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单细胞代谢组学全新上线 | Cell助力单细胞代谢组学研究！适度的紫外线照射可通过促进大脑谷氨酸生物合成途径增强学习和记忆

迈维代谢

2022.8.11

适度的紫外线照射可通过促进大脑谷氨酸生物合成途径增强学习和记忆

●发表期刊：cell

●影响因子：36.2160

●发表单位：中国科学技术大学

虽然紫外线暴露与几种皮肤病有关，但适度的紫外线暴露对人类健康是有益的。例如，UVB（户外紫外线，人皮肤晒伤的元凶）光是一种来自阳光的辐射能，它可促进皮肤中维生素D的生成。紫外线照射已被证实不仅能引起外周效应，还与中枢神经系统有关的各种神经行为（情绪、成瘾、认知和记忆）有关。然而，人们对紫外线诱导的神经行为改变的分子和细胞机制知之甚少。将紫外线照射引起的血液中小分子水平的变化与它们在大脑中的变化联系起来仍然具有挑战性，因为缺乏适当的技术支持来准确研究在单个神经元水平上测量细胞内代谢物的方法。随后研究人员建立了基于膜片钳和MS技术相结合的单细胞质谱（MS）方法，可用于研究单个神经元胞内成分的代谢过程。在本文中，研究人员使用这项新技术来探讨单神经元的分子和代谢机制，调节紫外线暴露诱导的神经行为变化，如改善运动学习和识别记忆。

1. 单细胞MS检测单个中枢神经元中的UCA（尿刊酸）

利用最近通过诱导纳米电喷雾(INESI)/高分辨率-MS与电生理膜片钳记录平台相结合而开发的技术，本文作者们已经在单个神经元中检测到数千种可能的化学成分，并在最近的报告中确定了50多种化学成分。除了检测到各种常规代谢产物，如氨基酸、糖、脂和神经递质，最引人注目的是在小鼠的单个海马区(HPC)神经元中发现了UCA(图1A和1B)，因为这种小分子以前从未在大脑中被报道过。此外，通过对来自HPC的单个神经元进行串联MS(MS/MS)证实了其化学结构(图1C和S1a)。在前额叶皮质(PFC)、次级运动皮质(M2)、杏仁中央核(CEA)、伏隔核(NAC)、背侧纹状体(DS)和HPC等6个脑区(图1D和S1B)均检测到UCA，表明UCA在脑内广泛分布。根据使用UCA标准品获得的校准曲线，单个神经元中的UCA浓度范围为55到95mM(图1E)。此外，UCA存在于脑脊液(CSF)中(图1F)。

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图1 单细胞质谱法鉴定神经元中的UCA

2. 紫外线照射会提高大脑中UCA的水平

已有研究表明，紫外线照射会改变周围皮肤、血液和尿液中的UCA水平。为了评估紫外线暴露是否也改变了大脑中的UCA水平，本文作者根据以前的研究结果开发了一个紫外线暴露的小鼠模型：将小鼠背部剃毛，并给予7mW/cm2的低剂量UVB（中波紫外线）2小时(图2A)，相当于30分钟的阳光暴露。UVB暴露后，血清UCA水平显著升高，这种升高持续了至少240分钟(图2B)，UVB照射120分钟后，脑脊液中的UCA水平也增加了2倍(图2C)。此外，单细胞MS显示，UVB照射2小时后，小鼠PFC、M2、HPC和DS等脑区单个神经元的UCA水平明显升高(图2D和2E)。UVB的这种效应是可逆的，因为在UVB暴露后24小时测量时，UVB诱导的细胞内UCA水平的增加降至接近零（详见补充材料图S2D和S2E)。

UVB暴露后脑内UCA水平升高的一个可能原因是血液中升高的UCA进入大脑。为了验证这一想法，作者随后进行了静脉注射。注射UCA，以剂量依赖的方式引发血清UCA水平显著升高。选择引起血液UCA升高幅度相似的UCA剂量(静脉注射，20mg/kg)，并在随后的实验中用于模拟UVB诱导的循环UCA升高。UCA确实显著增加了小鼠脑脊液中UCA的水平(图2F)。此外，静脉注射1,2,3-13C3-UCA后，血清、CSF(图2G)、HPC胞内(图2H)13C3-UCA明显升高，直接证明UCA能够穿过血脑屏障进入神经元。同时，与UVB暴露一致，静脉注射UCA也增加了PFC、M2、HPC和DS等相同大脑区域的细胞内UCA水平(图2I)。令人惊讶的是，UVB暴露和静脉UCA都没有影响NAc神经元细胞内的UCA水平(图2E、2I)，这可能是由于NAc中某些小分子的血脑屏障通透性比其他脑区低得多。总体而言，这些发现表明，循环中的UCA可能能够穿过血脑屏障，进入大部分大脑区域的神经元。

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图2 中波紫外线照射（UVB）对血清、脑脊液和单个神经元中UCA水平的影响

3. 组氨酸-UCA-谷氨酸：神经元谷氨酸生物合成的新途径

据报道，UCA只存在于外周系统，如皮肤、肝脏、血液和尿液中。在哺乳动物肝脏和其他外周组织中，UCA是组氨酸(His)转化为谷氨酸(GLU)的中间体(图3A)。有趣的是，单细胞MS分析不仅检测到His、UCA和GLU，而且在单个HPC神经元中还检测到另外两种参与肝脏His-UCA-GLU代谢途径的中间体，特别是4-咪唑酮-5-丙酸(IPPA)和甲氨基谷氨酸(FMGA)(图3B-3D)。为了验证His-UCA-GLU代谢途径在整个大脑中的存在，本文作者利用单细胞MS技术，在预先与His或生理盐水孵育的小鼠矢状面脑片上随机选择了15个脑区的300多个神经元，并对其细胞内样本进行了分析。His孵育后，各脑区细胞内UCA、IPPA、FMGA和GLU水平显著增加1~2倍，提示His-GLU代谢途径广泛分布于全脑。这种GLU生物合成途径可能存在于大脑中特定的细胞类型中，因为这些His代谢物的增加幅度在不同的神经元中不同，甚至在同一大脑区域。

稳定同位素13C标记是用于识别体内化学代谢途径的最常见方法之一。因此，作者接下来将13C-His(1-13C-His)与脑片中的PFC神经元孵育1小时，提取细胞内成分，并用单细胞MS进行分析。观察到，与未处理的神经元相比，13C-His预孵育的神经元中13C-His、13C-UCA/UCA、13C-GLU/GLU和13C-IPPA/IPPA的比率显著升高(图3E)，从而为单个神经元中His向UCA和GLU的转化提供了直接的证据。同时，Westernblotting分析表明，参与肝脏His-UCA-GLU途径的关键酶，包括组氨酸酶、尿素酶和咪唑酮丙酸酶(IPPAnase)，也存在于许多大脑区域，包括PFC、运动皮质(MC)、NAC、DS、CEA、HPC、上丘(SC)、下丘脑(HT)、小脑(CB)和脑干(BS)(图3F、3G)。免疫组织化学和原位杂交证实了这些关键酶的表达。此外，从小鼠脑中分离的突触体中也检测到这些酶，这表明在神经元突触终末中存在这一代谢途径。接下来，以二肽甘氨酸(GG)为尿刊酶抑制剂，检测尿刊酶在神经元中的生理作用。与HIS或UCA孵育均能显著增加神经元中GLU的浓度，而与GG预孵育可消除这种作用(图3H、3I)。此外，静脉注射13C3-UCA可显著提高HPC单个神经元13C3-UCA、13C3-IPPA、13C3-FMGA、13C3-GLU的13C/12C比值(详见补充材料)，说明UCA-GLU代谢通路在体内也起作用。

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图3 神经元HIS-UCA-GLU代谢通路的鉴定

4. 紫外线照射促进大脑中GLU生物合成

单细胞MS结果显示，UVB照射后小鼠单个神经元细胞内UCA、IPPA、FMGA和GLU代谢产物水平均显著升高。尿刊酶抑制剂GG可阻断UV（紫外线）诱导的GLU升高(图4A和4B)，但不能阻断UVB照射诱导的GLU升高，这表明UVB暴露诱导的GLU升高主要是由于激活了脑内UCA-GLU代谢途径。进一步证实了这一假说的证据表明，使用慢病毒ShRNAs抑制尿刊酶的表达也显著抑制了UVB暴露诱导的HPC神经细胞GLU(图4C和4D)的增加，但不能抑制UCA。为了排除UVB光通过小鼠视觉系统导致大脑UCA和GLU升高的可能性，作者使用了三重基因敲除(Gnat-/-;Cnga3-/-;Opn4-/-)视网膜中缺乏功能光受体并完全失明的小鼠。UVB暴露仍然显著增加了这些失明小鼠HPC单个神经元的UCA和GLU水平(图4E)，因此提示了一种独立于视觉系统的机制。

作者再次静脉注射UCA以模拟UVB诱导的血液UCA增加。单细胞MS显示不同脑区(包括PFC、M2、HPC和DS)的单个神经元的GLU浓度显著增加，但不包括NAc(图4F)。在体内，1H磁共振波谱(MRS)被应用于根据主要共振峰检测GLU信号，这些主共振峰显示出约2.3ppm的化学位移，代表大脑中的GLU浓度。本文作者进行了实验来确定全身给药UCA是否会在体内影响脑内GLU水平。对小鼠在9.4T时的MRS数据一致显示，静脉注射UCA后40分钟，HPC(图4G)和M2(图4H)中GLU信号均显著升高。

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图4 UVB暴露和静脉注射UCA对小鼠脑内GLU水平的影响

5. 中波紫外线（UVB）暴露后谷氨酸突触传递增强

除了参与蛋白质合成和细胞能量代谢外，GLU作为一种兴奋性神经递质在脊椎动物神经系统中发挥着不可或缺的作用。目前尚不清楚UVB暴露诱导神经元中GLU的增加是否影响谷氨酸突触传递。利用脑切片的电生理记录，接下来以HPCCA3区到CA1区神经元投射的GLU释放为例，因为这一通路是CA1神经元接收的两种主要谷氨酸输入之一。首先，将pAAVmCamKIIa-hChR2(H134R)-EGFP病毒注入CA3，沿GLUCA3/CA1神经元投影表达通道rhodopsin2(ChR2)(图5A和5B)。然后对CA1锥体神经元进行修补，只选取对蓝光(473nm)光刺激有反应的神经元进行后续测试(图5C)。小鼠暴露于模拟UV或UVB后，海马切片中记录了由单个囊泡自发释放GLU量产生的微型兴奋性突触后电流(mEPSCs)(图5D)。UVB暴露显著增加了振幅(图5E)，但没有增加mEPSCs的频率，因此提示神经元末梢中GLU水平可能增加。此外，在暴露于UVB之前，通过静脉注射GG(图5E和S5A)或hpc内CA3注射AAV-shRNA来抑制尿刊酶(图5F)这种作用也会减弱。

mEPSCs振幅的增加可能归因于每个量子(即每个突触前囊泡)包装更多的GLU内容，这与作者前期的研究结果一致，即如上所述，暴露于UVB会增加HPC神经元细胞内GLU水平。为了证实这一可能性，采用了光遗传学和多重概率波动分析(MPFA)相结合的方法，该方法有助于输入特异性量化谷氨酸突触传递的量子参数。为了刺激GLUCA3/CA1突触前末端，光学应用了一个五脉冲序列(20Hz)，用于MPFA将兴奋性突触设置为五种重复和一致的释放状态(图5G)。来自单个细胞的数据通常拟合出对称的抛物线曲线(图5H)，与突触传递的二项式模型一致。定量大小(Q)，代表来自GLUCA3/CA1神经元投射终端的单个突触前囊泡中GLU浓度，在UVB暴露后显著增加(图5I)。然而，其他可能影响谷氨酸传递的因素，如突触数量(N)和释放概率(Pr)，不受UVB暴露的影响。已有证据表明，从MC到DS的投射神经元也是谷氨酸能的。因此，接下来通过M2到DS的神经元投射来测量GLU的释放，因为M2中的细胞内GLU水平在UVB暴露后也增加(图4B)。

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图5 紫外线照射对HPCCA3到CA1的谷氨酸突触传递的影响

6. 紫外线照射通过大脑中的UCA-GLU代谢途径改善运动学习和识别记忆

越来越多的证据表明，从运动神经元到退行性椎体的谷氨酸回路参与了运动学习。因此，作者提出UVB暴露是否通过启动M2神经元的UCA-GLU代谢通路并随后激活GLUM2/DS回路来影响运动学习能力。小鼠在3次实验前接受50mJ/cm2的UVB暴露，每天进行2天的典型加速旋转训练(图6A)。小鼠在加速旋转任务中的运动技能学习在中波紫外线暴露后显著改善(图6B)。在暴露于UVB前15分钟，经腔静脉注射GG可明显抑制这种作用(图6C)。为了模拟UVB诱导的循环UCA增加，静脉注射UCA，观察到小鼠的轮状技能学习能力也显著增强。同时发现，这种作用可被脑室注射GG阻断。此外，有大量证据表明，GLUCA3/CA1神经元在长期识别记忆中发挥作用。因此，作者接下来进行了一项新的物体识别测试，以确定UVB暴露是否影响小鼠的识别记忆，以及是否涉及HPCCA3神经元细胞内的UCA-GLU代谢途径。老鼠被暴露在两个相同的物体中，这些物体被放置在相等的距离上(图6D)。探索每个物体所花费的时间被记录下来，并且物体偏好百分比显示左侧和右侧的两个物体没有差别。第二天，小鼠被允许在一个熟悉的物体和一个新的物体存在的情况下探索开阔的田野，以测试识别记忆。UVB暴露(图6E)以及静脉注射UCA，对小鼠的长期(24小时)而非短期(2小时)的识别记忆均有显著改善。

有趣的是，尽管不同性别的皮肤对紫外线的敏感性不同，但在UVB照射引起的大脑UCA-GLU代谢途径、轮状体学习和物体识别记忆的变化方面，雄性和雌性小鼠之间几乎没有差异。中波紫外线暴露诱导的识别记忆改善，可通过脑静脉注射尿刊酶抑制剂(图6F)或使用针对尿刊酶的慢病毒shRNA敲除HPCCA3区域的尿刊酶表达显著降低(图6G)。