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Sci Transl Med（IF: 19.319） | 单细胞测序和脂质组学技术助力早期肺癌检测！

鹿明生物

2023.6.26

研究背景

肺癌在全球人类所有肿瘤中的死亡率最高，发病率第二高。I期肺腺癌（LUAD）的5年生存率为60%以上，迫切需要早期检测以改善这种疾病患者的预后。美国国家肺癌筛查试验（NLST）报告表明，与胸部X光检查相比，使用低剂量计算机断层扫描（LDCT）筛查的肺癌死亡率降低了20%。随着高分辨率计算机断层扫描（CT）和LDCT筛查的应用范围扩大，早期肺癌的检出率也在提高，然而，LDCT的应用因其高假阳性率、辐射暴露和高成本而受到限制。建立有效方法来检测早期肺癌和筛选高危人群是重要的临床挑战。

前言

2022年2月2日，北京大学基础医学院王光熙副研究员课题组在Sci Transl Med期刊发表的题为“Lung cancer scRNA-seq and lipidomics reveal aberrant lipid metabolism for early-stage diagnosis”（IF: 19.319）的研究成果，通过单细胞测序、非靶与靶向代谢组、质谱成像技术，确定了9种脂质（溶血磷脂酰胆碱16:0、18:0和20:4；磷脂酰胆碱16:0-18:1、16:0-18:2、18:0-18:1、18:0-18:2和16:0-22:6；以及甘油三酯16:0-18:1-18:1）作为对早期癌症检测特征代谢物，构建了分类器模型，建立了LCAID v2.0平台（肺癌人工智能检测器），有助于肺癌的早期检测或对高危人群进行大规模筛查以预防癌症。

研究思路

通过单细胞测序、靶向代谢组、质谱成像技术建立了一个基于靶向脂质组学和ML（机器学习）的平台——LCAID v2.0有效检测早期肺癌。靶向脂质的定量比非靶代谢组学得到的定量更准确、更可靠，而且可以在其他实验室的不同LC-MS平台上重复进行。LCAID的准确性和高特异性可能有助于改善肺癌的临床检测和筛查，从而减少不必要的辐射暴露和侵入性诊断程序。

研究方法

研究材料：

（1）单细胞测序技术（scRNA-seq）：5个原发肿瘤；8个健康人肺组织；1个外部肿瘤

（2）血浆脂质组学：171名单一病灶直径≤3厘米的早期肺癌患者血样；140名健康成年人的血样

（3）机器学习分类器：训练集129名肺癌患者和105名健康参与者；测试集42名肺癌患者和35名健康参与者

（4）LCAID v2.0分类器：探索性队列171名T1期肺癌患者和140名健康参与者；训练队列350名肺癌患者和203名健康参与者；独立验证队列99名肺癌患者和40名非癌症患者

（5）LCAID v2. 0验证：1036名符合条件的参与者

研究技术：

(1) 单细胞测序技术

(2) 高效液相色谱-质谱（HPLC-MS）

(3) 机器学习支持向量机（SVM）

(4) 靶向LC-MS验证脂质标记物

(5) MALDI-MSI质谱成像技术

研究结果

1. scRNA-seq揭示了早期肺癌中异常的脂质代谢

图1| 早期肺癌和健康肺组织的scRNA-seq分析

作者利用单细胞RNA测序技术对肺癌组织中的细胞异质性和脂质代谢进行了研究。研究样本包括肺癌患者和健康个体的细胞，共分析了82,559个细胞，并标注了9个主要细胞系。结果显示肺癌组织中T淋巴细胞、B细胞和浆细胞比例增加，而单核吞噬细胞和内皮细胞比例下降，肺癌间存在高度异质性。将肿瘤细胞和正常上皮细胞进行比较，发现上调的差异表达基因（DEGs）构成了典型的肿瘤特征，许多下调的DEGs富集在脂质代谢相关的过程中。在脂质代谢方面，早期肺癌中与甘油脂代谢、甘油磷脂代谢、脂肪酸合成和不饱和脂肪酸生物合成相关的13条代谢途径失调，其中甘油磷脂代谢是肺癌细胞中最明显改变的脂质代谢途径之一，这些发现提示脂质代谢在早期肺癌中广泛失调。

图2| 脂质代谢通路在早期肺癌中广泛失调

2. 早期肺癌的血浆脂质组学分析构建早期肺癌非靶向脂质组学数据的SVM分类模型

对于每个样品，在正离子模式下共鉴定了1478个属于14类脂质的代谢物，在负离子模式下发现了708个属于13类脂质的代谢物。根据检测到的所有脂质，应用SVM（支持向量机）对病人和健康人进行分类。分别分析在正离子和负离子模式下收集的数据。对于正离子模式的数据，平均训练准确率被确定为100.00%，平均测试准确率为99.39%，特异性为98.74%，灵敏度为99.93%（图3：A和C）。负离子模式数据的平均测试准确率为98.70%，特异性为97.86%，灵敏度为99.41%（图3：B和D）。SVM显示出比随机森林和AdaBoost算法更好的性能。这种基于血浆脂质组学和机器学习（ML）的方法命名为肺癌人工智能检测器（LCAID）V1.0。

图3| LCAID v1.0的分类性能

3. 基于ML和MS的LCAID v1.0的特征选择

为了选择对早期肺癌与HCs的准确区分贡献最大的特征子集，进行了特征选择，根据平方值从大到小对平均权重进行排序，其中较大的值表示该特征在LCAID v1.0中的重要性。作者选择了重要性排名前100的特征来生成最终的预测模型进行特征选择经过基于ML的特征选择和基于MS的优化，在正离子模式下选择了4种脂质，在负离子模式下选择了8种脂质（图4：E），这些脂质以适合MS检测的最少的特征数量达到了最佳的分类性能。

这些选定的脂质在测试数据集上的分类准确率为：正离子模式下为98.91%，负离子模式下为97.47%该方法的AUC为正离子模式0.9994，负离子模式0.9917（图4：F）。同时，删除了负离子模式下的三种常见代谢物，并选择了正离子模式下的四种脂质数据和负离子模式下的其余五种脂质数据，以研究九种代谢物的最终模型的分类性能（图4：E）。在探索性队列的测试数据集上的分类准确性被确定为98.90%，平均AUC为0.9994（图4：G）。这些结果表明，所选的九个特征包含足够的信息来区分早期肺癌和HCs。

图4| LCAID v1.0的特征选择

4. 基于LC-MS的靶向脂质组学检测LCAID v2.0

基于对所选血浆脂质进行量化可以提高数据稳定性和检测准确性的假设，作者利用MRM开发了一种基于LC-MS的候选脂质的定向检测方法。从负离子模式和正离子模式列表中选择了所有9种脂质（图4：E）。经过参数优化，包括LC洗脱梯度调整、过渡选择、碰撞能量和解聚潜力优化，构建了一个有针对性的脂质体测定方法，可以在一次19分钟的LC-MS运行中对这9种脂质标记物进行定量（图5：A）。作者将这种定量方法命名为LCAID v2.0。

图5| LCAID v2.0方法的建立和统计分析

为进一步测试LCAID v2.0的分类性能，作者对来自四个医疗中心的1003名参与者的血浆进行了基于LCAID v2.0的分析。LCAID v2.0产生的数据与训练队列和独立验证队列都显示出一致的表达模式，并且可以通过t-SNE进行有效聚类（图5：B和D）。根据训练队列的数据建立了一个SVM模型，并在独立验证队列中评估了该模型。LCAID v2.0的分类准确率达到96.98%，特异性97.08%，敏感性96.92%，在独立验证队列中，准确率为94.96%，特异性为100.00%，敏感性为92.93%。独立验证队列中没有无癌症患者被LCAID v2.0错误分类。训练队列的AUC达到0.9956，独立验证队列的AUC达到0.9982，精准度-召回曲线表现良好（图6：A至D）。这些结果说明了LCAID v2.0的稳健性和准确性。

图6| LCAID v2.0中8种脂质用空间脂质组验证

5. LCAID v2.0LCAID v2.0在肺癌临床检测和筛查中的前瞻性评估

作者前瞻性地研究了LCAID v2. 0在医院接受年度体检的队列中的表现，其中1036名符合条件的参与者在中国北京航天731医院接受年度LDCT筛查，以及来自两个胸外科的前瞻性单盲队列（其中109名符合条件的参与者）。在前瞻性队列中，86名参与者被诊断为肺癌，23名参与者被诊断为良性疾病。应用于该队列时，LCAID v2.0达到了91.74%的准确率，特异性为95.65%，敏感性为90.70%，以及AUC为0.9843（图6：E和F）。LCAID v2.0在筛查队列中的分类准确性达到96.53%，特异性为96.58%，敏感性为92.31%，以及AUC为0.9557（图6：G和H）。这些队列中的大多数肺癌患者处于TNM I期（68.69%至76.92%），90%以上的I期肺癌被准确检测出来。这些结果共同证明了LCAID v2.0在临床和普通人群中检测肺癌的高准确性和特异性。

6. LCAID V2.0的特征脂类在LUAD组织中的原位表达

在肺癌患者的血浆中，PC和TG的表达量增加，而LPC则减少（图5：B）。MALDI-MSI被应用于检测12名患者的肺癌组织和邻近肺组织中LCAID v2.0的特征脂类（图：7）。在这些手术切除的组织中，通过MALDI-MSI原位检测到9种特征脂质中的8种（图7：C和D）。与邻近的肺组织相比，五种PC高度表达，而三种LPC在肺肿瘤中表达下降。这些MALDI-MSI结果证实，LCAID v2.0的8种特征脂质在LUAD组织中持续发生改变（图7：E和F）。

图7| LCAID v2.0对早期肺癌原位组织的特征脂质的MALDI-MSI分析

研究结论

作者建立了基于靶向脂质组学和ML的平台——LCAID v2.0，能够有效检测早期肺癌。scRNA-seq分析显示，在早期肺癌中，甘油磷脂和甘油脂的代谢途径在肿瘤细胞以及T细胞、B细胞、NK细胞和成纤维细胞中都出现失调。血浆中检测到的PC、LPC和TG的改变可能是肺癌组织中脂质代谢紊乱的标志。靶向脂质的定量比非靶向代谢组学得到的定量更准确、更可靠，而且可以在其他实验室的不同LC-MS平台上重复进行。LCAID的准确性和高特异性可能有助于改善肺癌的临床检测和筛查，从而减少不必要的辐射暴露和侵入性诊断程序。

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靶向代谢组和空间代谢组质谱成像技术各有优势，在疾病的研究均发挥了重要作用。本文将二者有机结合，并使用自主研发的了LCAID v2.0平台（肺癌人工智能检测器），可降低肺癌临床诊断的假阳性率、减少辐射暴露和减低成本，是早期肺癌和筛选高危人群的潜在有效手段，值得特别关注。

（参考文献）

PMID: 35108060 DOI: 10.1126/scitranslmed.abk2756

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