文献解读｜IF=16！单细胞代谢组和蛋白质组助力细胞分型

迈维代谢

2022.9.05

●发表期刊：Angewandte Chemie International Edition

●影响因子：16

●发表时间：2021.01

检测单细胞蛋白质组和代谢组具有重要意义，因为它们分别是生命运动的主要承担者和细胞行为的最终产物和必要介质。单细胞中内容物体积少、含量低、种类多、分析窗口有限，使得高灵敏、高信息覆盖度、快速、高通量的单细胞分析面临重大挑战。通过单次测量实现多维度、多参数的单细胞定量信息获取，对于细胞分型、鉴定以及单细胞水平的疾病相关分子机制研究具有重要意义。高灵敏度和丰富的信息使质谱(MS)成为测定单细胞蛋白质和代谢物的有力工具。

本文研究者提出了一种基于纳米电喷雾质谱(NanoESI-MS)的多维有机质细胞测定系统（方案图)，该系统能够同时分析单个细胞的蛋白质和代谢物的多参数。通过在金纳米颗粒(GNPs)上组装罗丹明质量标记(RMTs)和特异性抗体，制备了一系列质量探针(MPs)。RMTs通过Au-S键自组装在GNPs上，并在nanoESI过程中直接解离，将蛋白质信号转化为RMTs的放大和简化信号，保证了单细胞蛋白质的敏感性和高通量。重要的是，同时可以检测到细胞代谢物，RMTs的质荷比(m/z)和强度与代谢物的质荷比(m/z)和强度兼容，从而促进了蛋白质和代谢物的互补数据获取和定量。为了高效和有序的分离细胞，将一个简单的微流控芯片连接到纳米电喷雾发射器上，建立了芯片-纳米ESI质谱分析系统，进一步保证了高通量的单细胞检测。研究者将这种单细胞蛋白和代谢的检测方法在三种卵巢癌细胞类型(A2780,OVCAR-3和SK-OV-3)和两种乳腺癌细胞类型(MCF-7和MDA-MB-231)中做了验证。

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方案图

1.单细胞表面抗原检测

用6种MPs标记细胞表面的6种抗原，包括3种重要的癌症生物标志物癌抗原125(CA125)、癌胚抗原(CEA)和上皮细胞粘附分子(EpCAM)，以及3种常用的簇分化抗原CD24、CD44和CD133，通过有机质细胞测定系统检测后进行半定量。在单细胞水平成功检测出6种细胞表面抗原(图1b)。5种细胞类型和亚型之间的表面抗原表达存在显著差异(图2a)。例如，EpCAM作为一种重要的上皮癌变功能蛋白，在大多数上皮癌细胞系中均检测到，包括SK-OV-3、MCF-7、A2780和OVCAR-3，但在MDA-MB-231细胞系中未检测到。采用金标准荧光流式细胞术对半定量结果进行验证。RMTs固有的荧光信号使这些MPs双功能探针额外用于基于荧光的流式细胞术。因此，RMTs标记的细胞直接进行商业流式细胞仪检测。荧光强度测量得到的半定量结果与有机质细胞测定系统得到的结果非常一致，例如通过基于MS强度比(图2b)和荧光强度(图2c)的分布曲线可视化EpCAM的相对表达。此外，在蛋白质半定量中，使用商业荧光标记抗体获得的结果与使用MPs获得的结果令人满意地一致，这进一步证实了使用基于MP的有机质细胞测定系统可对单细胞蛋白质做特异性标记和检测。

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图1

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图2

2.单细胞代谢物谱分析和细胞分型

在单细胞质谱中，除细胞表面蛋白外，还同时鉴定了细胞代谢物。由于单个细胞的代谢物的直接串联质谱扫描时间有限(约0.32s)，因此对整个细胞的代谢物提取进行分析，以获得准确的质量和串联质谱信息，以协助代谢物分配。分配的代谢物主要包括氨基酸或多肽(脯氨酸、缬氨酸、苏氨酸、亮氨酸、肌酸、谷氨酰胺、精氨酸、半胱氨酸甘氨酸和谷胱甘肽)和脂类[包括PC、甘油磷酸甘油(PG)、甘油磷酸乙醇胺(PE)、甘油三酯(TG)等)。值得注意的是，大部分代谢物是从细胞膜和细胞质中提取或释放的。这主要是由于电喷雾过程中细胞裂解和代谢物提取的相互作用时间短。细胞代谢物、表面抗原在不同细胞亚型中有统计学差异。结合蛋白/代谢物信息可获得最敏感和特异的细胞分型和鉴定分化结果（图3）。有机质细胞分析平台具有更全面、准确、高效的细胞分型能力，具有在单细胞水平进一步进行生物分析的潜力。

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图3

3.化疗耐药性的细胞异质性分析

单细胞检测技术的发展揭示了细胞类型之间的异质性，更重要的是克隆群体的异质性，这对癌症治疗中的耐药分析和干细胞研究至关重要。为了研究单细胞水平的耐药性，研究者用野生型MCF-7(wt MCF-7)细胞暴露于阿霉素后诱导阿霉素耐药表型(DOX-res)MCF-7细胞，利用本文的检测技术在单细胞水平对DOX-res和wtMCF-7细胞进行分化。DOX-res细胞表面抗原表达谱分化明显。CD44+CD24^low/-DOX-resMCF-7细胞与大多数CD44+CD24+MCF-7细胞明显区分（图4a）。

在DOX-res和wtMCF-7细胞之间也选出了具有统计学差异的代表性代谢物，包括氨基酸(精氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸)和脂质[鞘磷脂SM(D34:1)、PC(38:4)和PC(O-32:0)；图4b]。这些差异代谢产物可能与细胞代谢途径和特殊的细胞形态有关，是识别耐药细胞的潜在指标，为分析耐药机制和癌细胞的存活、分化和衰老提供了表型证据。

在WtMCF-7细胞群的结果中，CD24相对表达较低的细胞数量非常少(图4a)，这个结果与荧光流式细胞术观察到的结果相同。wtMCF-7细胞中的这些小簇可能是耐药细胞，并可能具有其他干细胞样特征，如自我更新和分化，这在癌症治疗中备受关注。对耐药癌细胞的分析进一步证明了有机质细胞测定系统是一种用于细胞异质性分析和细胞表型鉴定和识别的强大单细胞测量技术。

本文研究者开发了一个多维有机质细胞检测平台，用于同时分析单细胞蛋白质和代谢物。以每分钟约40个细胞的通量分析细胞悬液，以单细胞分辨率提供6个蛋白质参数和约100个代谢物参数。基于全面的细胞表面抗原和细胞代谢物，可以更好地区分和识别癌细胞表型和实质性异质性，实现95%以上的细胞分型灵敏度和特异性。此外，基于抗原标记识别了MCF-7中的耐药性和干细胞样细胞，并发现了代谢差异，用于进一步的耐药性分析和干细胞研究。文中的技术提供了在单细胞水平上深入理解基本的生物学过程(如分化、衰老和致病)很高的可能性。