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项目文章 | 单细胞和空间转录组测序助力人类早期椎间盘形成的单细胞时空图谱构建
2023年3月25日，中山大学附属第一医院苏培强教授团队开联合厦门大学医学院的许韧教授团队，在Advanced Science（IF:17.521）上合作在线发表了题为“Spatiotemporal characterization of human early intervertebral disc formation at single-cell resolution”的研究文章。
本文收集人类和小鼠早期IVD形成时期的脊柱标本进行单细胞转录组测序和空间转录组测序，描述了NC/NP、椎体软骨、纤维环及类生骨节（Sclerotome）的细胞异质性与分子表达特征，并鉴定到了IVD新细胞亚型以及与椎间盘微环境相关的关键调控因子。首次描绘了人类和小鼠早期椎间盘形成的时空转录图谱，从发育角度探索IVD，为IVD退变的再生治疗策略提供了新的研究视角。欧易生物提供了该项目的单细胞转录组测序和空间转录组测序实验和分析工作。
接下来，我们具体解析一下该项目的研究思路和实验内容。
期刊：Advanced Science
影响因子：17.521
发表年月：2023年03月
材料：脊索阶段胚胎（Noto，第7周，n = 4）vs过渡阶段胚胎（Trans，第8和第9周，n = 4）vs髓核样阶段胚胎（NPL，第10和第11周，n=5）;受精后11.5的小鼠（E11.5）vs受精后13.5天的小鼠（E13.5）vs受精后15.5天的小鼠（E15.5）用于单细胞测序；受精后11.5的小鼠（E11.5）vs受精后12.5天的小鼠（E12.5）vs受精后13.5天的小鼠（E13.5）用于空间转录组测序
方法：10x Genomics单细胞转录组测序及空间转录组测序
中轴骨骼由椎体（VBs）、椎间盘（Intervertebral disc, IVD）以及附着的肌腱/韧带和肌肉组织组成。IVD主要负责维持中轴骨的机械稳定性，成熟的IVD由位于中央起源于脊索（Notochord，NC）的髓核（Nucleus pulposus，NP）、环绕的纤维环 （Annulus fibrosus，AF）及两端与椎体毗邻的终板（Endplate，EP）组成。胚胎IVD形成的特征是脊索NC到髓核NP的转变，据报道，NC细胞是所有NP细胞的前体，NC细胞的减少与IVD退变（IVDD）的发生密切相关。然而，目前尚缺乏胚胎早期椎间盘形成的时细胞图谱，对IVD形成和变性的脊索向髓核转变过程中的细胞异质性理解不足，限制了科学家们对IVDD疾病治疗方法的研究。
在本研究中，作者分析了来自13个不同妊娠周的人类胚胎的中轴骨骼的177 725个细胞，提供了人类早期IVD形成的单细胞图谱。通过对小鼠中轴骨骼进行单细胞测序，进一步揭示了人类和小鼠脊索/髓核细胞亚群组成的保守性与多样性。结合谱系追踪和空间转录组分析，全面描述了发育中的NC/NP细胞、椎体软骨细胞和IVD形成早期的AF细胞的空间转录组特征。研究团队鉴定到两个新的NC/NP簇以及潜在的AF/EP祖细胞，并解码了与早期IVD形成有关的细胞间串扰。此篇研究系统描述了人类和小鼠早期椎间盘形成的时空转录图谱，为与早期IVD形成相关的转录改变提供了新的细胞水平的见解，为IVD退变的再生治疗策略提供了全新研究视角。
Result1 早期IVD形成过程中胚胎轴向骨骼细胞图谱
为了探究早期IVD形成过程中的中轴骨骼的细胞图谱，作者收集妊娠第7-11周形态正常的13个胚胎，这些胚胎样本分别处于三种阶段：脊索阶段（Noto，第7周，n = 4）、过渡阶段（Trans，第8和第9周，n = 4）和髓核样阶段（NPL，第10和第11周，n=5）（图1B），分离其中的中轴骨骼用于单细胞测序：包括椎体（VB）、纤维环（AF）、髓核（NP）和其他粘附的软组织（即肌肉、肌腱和韧带）（图1A）。根据marker表达情况，细胞类型注释如下：软骨hChon、结缔组织 hCT、脊索hNC、肌肉hMuscle、神经元hNeuron、免疫细胞hImmun、内皮细胞hEC、周细胞hPericyte和以及处于细胞周期中的细胞hCycle（图1D）。
后续作者比较了各细胞类型在IVD形成过程中的细胞占比，随着IVD的发展，hNCh和hCycle的细胞比例均有所下降，hEC和hPericyte 的比例有所升高，这些结果反映了在VB形成过程中，软骨内骨化与血管生成的增加是密切相关的（图1E）。
图1.1 早期IVD形成期间的胚胎中轴骨骼的单细胞图谱
为了进一步研究人类和小鼠在早期IVD形成过程中的异同，作者收集了受精后11.5、13.5和15.5天的小鼠中轴骨骼并进行了scRNAseq，鉴定了10种细胞类型：软骨(mChon）、结缔组织(mCT）、脊索(mNC）、肌肉（mMuscle,）、神经元（mNeuron）、免疫细胞（mImmune）、内皮(mEC）、周细胞（mPericyte）、处于细胞周期的细胞(mCycle）和血细胞（mBlood）（图1F、G）。
对人和小鼠各细胞类型的转录组进行相关性比较，发现人和小鼠之间各细胞类型存在高度相似的转录信息（图1H）。
图1.2 早期IVD形成期间的胚胎中轴骨骼的单细胞图谱
Result2 IVD发展过程中NC/NP的细胞图谱及表达特征
为了更好地研究脊索细胞，作者对hNCs和mNCs进行了亚型分析，hNCs分为7个亚群：TBXT+、SOX10+、CTSK+、NPY+、KRT15+、PDGFRA+和APOA1+ ，mNCs也被分为7个亚群：T+ , Sox10+, Ctsk+, Krt15+ , Rprm+, Tcf21+和Adipoq+。作者进一步比较了人源和鼠源脊索细胞的7个亚群在IVD发展各阶段的比例，发现SOX10+和Sox10+亚群主要分布在Noto阶段，CTSK+和Ctsk+亚群比例随着IVD的发展而上升，TBXT+和T+与KRT15+和Krt15+的比例随IVD发展而减少（图2A）。接下来，作者探究了SOX10+和Sox10+亚群的特征基因（图2B），并发现SOX10+和Sox10+亚群的基因表达量随着NC-to-NP脊索向髓核阶段的转变而降低（图2D，E），随后作者结合谱系追踪，描述了早期IVD形成期间Sox10+亚群的变化（图2F，G）。
作者对脊索细胞进行功能分析，SOX10+和Sox10+亚群的功能主要富集在调节上皮管形态发生、间充质发育和软骨发育方面（图2H）。此外，SOX10+亚群高表达BMP7、SPINT2和CLDN3/4/6/7，这对神经管的关闭至关重要。进一步结合SCENIC分析揭示SOX10+的单细胞调控网络，SOX10、FOXG1和SIX1等调控基因在SOX10+亚群中富集。SOX10调控的下游靶基因富集于“Notch信号通路”、“神经管关闭”和“激活素受体信号通路正调控”，揭示SOX10+亚群与脊索细胞发育密切相关。APOA1+亚群功能富集在维黄酸结合、维甲酸合成和视黄醇转运通路上，揭示了APOA1+亚群与神经管/脊髓的形成的相关性。基因集变异分析GSVA显示Tcf21+亚群与“脊索形态发生”密切相关，表明Tcf21+亚群可能参与了调节脊索发育和神经管闭合。Rprm+亚群功能富集揭示Rprm+亚群可能参与了维甲酸和神经管相关过程。NPY+亚群只分布在Noto期，优先表达WT1和WNT5A，这是前后轴特异化所必需的（图2A、B），NPY+亚群可能与“脊索形态发生”相关（图2I)。
图2 早期IVD形成过程中NC/NP细胞的特征
Result3 TBXT+和CTSK+是两个主要的基质体簇，在早期IVD形成期间调节细胞外基质（ECM）稳态
成熟的髓核NP含有多种ECM蛋白，包括蛋白多糖、纤维胶原和弹性蛋白纤维，它们可以维持IVD的高度和静水压。作者发现ECM蛋白，如ACAN和COL1A1，随着IVD的发展显著增多（图3A）。激光捕获显微切割（LCM）捕获的人类胎儿NC/NP组织的RNA-seq结果也显示，随着妊娠周期（9-13周）的增长，胶原蛋白（COL2A1和COL11A1）和蛋白聚糖（ACAN和FMOD）的表达有所升高（图3B）。
为了研究NC/NP细胞中与ECM稳态相关的细胞异质性和分子动力学，作者对NC细胞的7个亚群开展了相关研究。ECM基因被分为核心基质（胶原蛋白、蛋白多糖和糖蛋白）和基质体相关基因（分泌因子、ECM归属和ECM调节因子）。作者首先评估了hNC 7个亚群中以上6个模块的平均表达量，并比较了亚群中ECM基因的表达丰度（图3C、D）。GO分析表明，CTSK+亚群可能优先参与NP组织中的胶原合成，且与“TGF-β信号通路”有关，这对NP细胞维持和ECM稳态至关重要（图3E）；TBXT＋亚群可能主要与NP组织中的蛋白聚糖合成有关（图3F）。综上，ECM稳态主要受TBXT+和CTSK+亚群的调控。
图3 早期IVD形成过程中基质体簇的特征
在人类胎儿脊柱中，Noto期几乎没有CTSK的表达，其表达随着发育过程中NC/NP细胞里ECM的形成而增加（图3A，G），这与人类胎儿LCM标本中CTSK的表达趋势一致（图3B）。接下来，作者基于谱系追踪进一步研究Ctsk在早期IVD形成过程中的动态表达，将Ctsk-Cre小鼠与mT/mG小鼠杂交，值得注意的是，GFP+Ctsk谱系的细胞数量随着IVD的发展而增加（图3H），这与上述结果一致。这一发现表明，CTSK是NC/NP细胞发育的晚期标志物，并且CTSK+亚群可能负责纤维软骨NP中的ECM稳态。
图3 早期IVD形成过程中基质体簇的特征
以上，作者研究了NC/NP细胞与ECM稳态相关的细胞异质性和分子动力学，提出TBXT+和CTSK+是在人类IVD形成过程中起作用的主要细胞群。
Result4 IVD形成过程中脊椎软骨细胞和外层纤维环（OAF）的细胞特征
为了表征发育过程中脊椎软骨细胞的动力学和相关功能，对hChon和mChon细胞进行亚型分析：hChon1-4（图4A），由于细胞数量有限，mChon最终只被细分为Col2a1+和Col1a1+簇。Noto期的轴软骨主要由hChon1和hChon2组成，hChon1中MATN1和CYTL1有较高表达（图4B-D），hChon1在与“软骨发育”和“ECM组织”相关通路上富集，表明hChon1可能形成中心软骨原基。hChon2高表达软骨膜细胞的标记物（图4B、C）。hChon3的占比随VB的发育而增加（图4A），hChon3细胞高表达VEGFA（血管生成）和HHIP（IHH靶基因）（图4B），且富集分析揭示其与“缺氧反应”、“骨化”和“成骨细胞分化”相关，表明hChon3在调节软骨内骨化中具有潜在作用。hChon4仅分布在NPL阶段（图4A），高表达EBF1、NFAT5和SOX9，其中SOX9是软骨细胞中的关键转录因子，而NFAT5有助于IVD胚胎发生，这些数据表明hChon4与EP、IAF发展有关，可能是一种软骨生成祖细胞。
图4 早期IVD形成过程中椎体软骨细胞的特征
拟时序分析揭示了软骨细胞各亚型在发展过程中的分化轨迹（图4G）：hChon1主要分布在拟时间起始端，这与RNA速率分析一致。轨迹在后期发展成两个分支：hChon3（调节软骨内骨化）和hChon4（调节EP/IAF发育）（图4G）。软骨生成基质相关特征基因：COL1A1、VEGFA和 HHIP的表达沿ECO分化轨迹增加，而MATN1、GDF5、CSGALNACT1、和CYTL1的表达沿EP/IAF轨迹增加（图4H）。值得注意的是，据报道，PDPN+CD146（MCAM）+骨/软骨/基质祖细胞（BCSP）可分化为PDPN+CCD146（MCAM）−软骨祖细胞和PDPN-CD146（MCAM）+骨和基质祖细胞。MCAM的表达沿着ECO分支增加，表明hChon3可能调节VB骨化（图4H）。
图4 早期IVD形成过程中椎体软骨细胞的特征
作者接下来对结缔组织进行了研究，在hCT中cluster6高表达PAX1和PAX9，且较高表达MKX和COL5A1（图5A、B）。已知MKX在外层纤维环OAF中优先表达，并促进再生，因此作者将cluster6定义为正在发育的OAF（图5B，C）。在小鼠mCT中，作者发现cluster4优先表达Pax1、Mkx和Pdgfrl（图5D，E），将cluster4定义为小鼠中正在发育的OAF。Tagln和Fmod在小鼠OAFs中的表达也通过免疫染色进行了验证（图5F）。
图5 早期IVD形成过程中OAF细胞的特征
以上研究揭示了人类早期IVD形成过程中脊椎软骨细胞的功能和发育轨迹，表征了间充质衍生的OAF在IVD早期形成过程中与软骨源性IAF不同的变化特征。
Result 5 IVD形成过程中NC/NP细胞与脊椎软骨细胞之间的通讯网络
作者接下来研究了NC/NP细胞和脊椎软骨细胞的相互作用（图6A）。hChon3通过TGFB1–TGFBR3调节发育中的NC/NP细胞（图6B）。TGF-β家族对IVD的正常形成和ECM代谢至关重要。TGF-β信号通路的主要受体细胞是CTSK+、TBXT+和PDGFRA+亚群。同时，作者发现潜在的EP/IAF祖细胞（hChon4）通过BMP2-SMO和BMP7-PTPRK调节NC/NP（图6B）。这些数据表明，来自椎体软骨细胞的TGF-β和BMP信号可调节发育中的NC/NP细胞的合成代谢。
发育中的NC/NP细胞分泌的WNT4/5和FGFR1/2/3对脊椎软骨细胞的发育起到了调节作用（图6C）。值得注意的是，作者发现发育中的NC/NP细胞，特别是TBXT+、SOX10+亚群通过SPP1–CD44与hChon3相互作用（图6C-E）。CD44除了是干细胞标志物外，在包括肢体发育在内的各种生理过程中也发挥着重要作用，CD44表达较高的软骨细胞表现出更高的软骨生成能力（图6D，F）。作者构建了小鼠模型进一步研究SPP1在调节软骨形成中的作用，重组小鼠Spp1（rSpp1）中软骨形成主调节因子（Sox9）的表达显著上调，非诱导ATDC5软骨形成祖细胞中血管形成关键调节因子（Hif1a、Vegfa）和hypertrophic标志物（Runx2和Cd9）表达下调（图6H），而在CD44单克隆抗体给药组中，这些变化被遏制（图6H）。作者进一步发现，在穿刺诱导的IVDD大鼠模型中，Spp1的表达显著下调，而hypertrophic标志物（Vegfa和Col10a1）的表达显著升高（图6I）。这些结果表明，SPP1可能通过与CD44相互作用抑制肥大和血管形成，同时刺激软骨形成。
作者发现维持无血管环境所需的SEMA3E在SOX10+和CTSK+亚群中表达，并且SEMA3A在CTSK+中的表达随着IVD的发展而增加。这些结果表明，除了TBXT+亚群，SOX10+和CTSK+也在NC/NP发育中发挥了维持无血管微环境的潜在作用。
图6 在早期IVD形成过程中NC/NP和椎体软骨细胞之间的通讯网络
此部分研究揭示了发育中的NC/NP细胞和脊椎软骨细胞之间存在复杂的细胞串扰和分级信号通路，并进一步证明了包括SPP1和信号素SEMA3A在内的相关信号对IVD的形成至关重要。
Result 6 人和小鼠结缔组织的细胞特征
作者进一步对结缔组织进行了亚型分析：hCT中的cluster 11和14根据TNMD和SCX的表达被鉴定为腱细胞（hTN），将剩余的hCT分为六个亚群，hCT1（FOXC2+ZIC1−NRP1+）、hCT2（UNCX+FOXC2+ZIC1−）、hCT 3（PAX1+FOXC2+ZIC1+）、hCTC4（PAX1−FOXC2+ZIC1+）、hCT5（FOXC2−ZIC1+），和hCT6（TPPP3+PDGFRA+）（图7A、B）。作者进一步对这些亚群进行了功能富集分析（图7C）。
同样对mCT进行了亚型分析，分为七个亚群：mCT1-7（图7D，E）。mCT1-3亚群根据Foxc2、Pax1、a n d Pax9的表达被鉴定为间充质硬皮瘤，mCT6亚群根据Tppp3和Cd34的表达被识别为肌腱干细胞。
图7 发育中的IVD的结缔组织亚群分析
Result 7 空间转录组表征IVD发展过程中的细胞时空特征
作者通过空间转录组更好地表征IVD发育过程中的细胞空间图谱，E11.5和E12.5时期的轴向骨骼包括两个主要的亚簇：致密软骨Chon1（Pax1+Uncx+Pax9+）和疏松软骨Chon2（Dcn+Igfbp2+）（图S13A）。在E13.5时期，AF高表达Pax1、Bgn和 Tgfbi，Chon优先表达Matn1、Comp和 Mia。作者发现Pax1主要在腹侧轴骨架中表达，而Zic1优先在背侧区域和脊髓中表达（图S13B），这与单细胞数据一致。
基于空间转录组数据作者进一步确定了发育中NC/NP细胞的标志基因，与单细胞数据一致：NC细胞优先表达典型的脊索标记物（Car3，Shh，Krt19和 Krt18）以及定义的新marker Spp1和Sox10（图S13C、D）。在E11.5-E13.5时期的NC/NP细胞中检测到Ctsk的低表达（图S13E）。
有趣的是，作者发现先前报道的NC/NP标记物Lepr在E11.5和E12.5时期优先表达，其表达随着小鼠IVD发育而降低（图S13F、G），而在人类NC/NP细胞中观察到Lepr的持续低表达（图S13G），表明在IVD发育过程中，人和小鼠存在不同表达模式。
图S13 小鼠不同发育阶段的空间细胞图谱
本研究通过收集人类（孕7-11周）和小鼠（受精后11.5-15.5天）早期IVD形成时期的脊柱标本进行单细胞转录组测序和空间转录组测序，首次描绘了人类和小鼠早期椎间盘形成的时空转录调控图谱，揭示了NC/NP、椎体软骨、纤维环及类生骨（Sclerotome）的细胞异质性与分子表达特征，并结合小鼠谱系示踪SOX10+、CTSK+等新IVD细胞亚型。该文章还揭示了早期IVD形成过程中的分子调控网络，发现了与IVD的发育和退化有关的调控因子，为从发育角度探索IVD退变的再生治疗策略提供了全新研究视角。
参考文献
Zhou Taifeng, et al. Spatiotemporal Characterization of Human Early Intervertebral Disc Formation at Single-Cell Resolution..[J].Advanced science,(2023)
doi:10.1002/ADVS.202206296.
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排版人：小久
原创声明：本文由欧易生物(OEBIOTECH)学术团队报道，本文著作权归文章作者所有。欢迎个人转发及分享，未经作者的允许禁止转载。
