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Cancer Cell重磅！曹雪涛/张迁团队揭示O-糖基化修饰介导的促肿瘤转移和化疗抵抗新机制
在肿瘤微环境中存在的多种免疫细胞受到肿瘤细胞及其微环境中信号、营养物质介导的驯化并参与肿瘤的免疫逃逸和助力肿瘤细胞的生长和转移。肿瘤相关巨噬细胞 (tumor associated macrophage，TAM) 作为一种主要的肿瘤浸润免疫细胞，M1样TAM可能参与抑制肿瘤进展，而M2样TAM能够促进肿瘤的生长、侵袭、血管生成以及化疗抵抗。对于TAM及其亚型的葡萄糖吸收及其胞内代谢如何塑造M2样TAM特异性功能，以促进肿瘤的转移和化疗抵抗是肿瘤免疫学领域亟待探究的一个重要科学问题。
2022年9月8日，中国医学科学院基础医学研究所曹雪涛院士/张迁教授团队在 Cancer Cell (IF=38.584) 上在线发表了题为“Increased glucose metabolism in TAMs fuels O-GlcNAcylation of lysosomal Cathepsin B to promote cancer metastasis and chemoresistance” 的最新成果，研究报道了TAM中葡糖糖代谢通过增强溶酶体组织蛋白酶Cathepsin B的O-GlcNAcylation 促进肿瘤转移和化疗抵抗，首次揭示了M2样TAM是肿瘤微环境中葡萄糖摄取能力最强的免疫细胞亚群，并首次发现了定位于溶酶体的O-连接的N-乙酰葡萄糖胺转移酶(O-Linked N-Acetylglucosamine Transferase，OGT) 的新功能。景杰生物为该研究提供了O-糖基化修饰组学 (O-GlcNAcylation) 分析技术支持。
1. M2样TAM具有更强的单细胞葡萄糖吸收能力
为了鉴定 TAMs 中特异表达的基因，研究者首先利用单细胞转录组测序发现Glut1在 M2 样 TAMs 中特异性高表达，Glut1 是巨噬细胞中主要的葡萄糖转运蛋白。此外，与腹膜和脾脏巨噬细胞和外周血单核细胞相比，TAMs 在体外和体内的葡萄糖摄取能力最高。这些结果表明，TAMs，尤其是表达高水平 Glut1 的 M2 样 TAMs，在 TME 中具有更强的葡萄糖摄取能力以发挥其促肿瘤功能。
图1 M2 样 TAMs 在 TME 中具有较高的葡萄糖摄取能力
2. TAM吸收的葡萄糖通过HBP途径促进溶酶体OGT对Cathepsin B进行O-GlcNAcylation
己糖胺生物合成途径 (HBP) 是糖代谢的主要途径，可合成核苷酸糖 UDP-GlcNAc，随后用于调节营养感知和应激反应的细胞内蛋白质的翻译后修饰——O-糖基化修饰(O-GlcNAcylation)。有研究指出，O-GlcNAcylation 可调节巨噬细胞在病原体感染和炎症中发挥重要作用。
该研究发现HK1/2可催化糖酵解的限速步骤。在指示葡萄糖代谢途径中的限速酶中，HK、GPI、GFAT、OGT 在 M2 样 TAMs 中同样高表达，表明在 M2 样 TAMs 中 HBP 和 OGT 介导的蛋白 O-GlcNAc 糖基化修饰活性增加。随后发现利用泛葡萄糖转运蛋白 (GLUT) 抑制剂 DRB18 对葡萄糖摄取的抑制显著降低了 O-GlcNAcylation 的水平，意味着 TAMs 对葡萄糖的摄取主要是通过 HBP 途径和 O-GlcNAcylation。此外研究还发现IL-4 可能参与重塑 M2 样 TAMs 中的葡萄糖代谢和 O-GlcNAcylation 反应。
图2 M2 样 TAMs 中 HBP 和 OGT 介导的蛋白 O-GlcNAc 糖基化修饰活性增加
接下来研究通过蛋白-蛋白相互作用组、溶酶体分离实验和confocal分析发现OGT可定位于溶酶体，O-糖基化修饰组学分析进一步聚焦发现Cathepsin B的210位丝氨酸 (S210) 发生了O-GlcNAcylation修饰，且M2极化信号和葡萄糖摄取均可促进溶酶体OGT对Cathepsin B的修饰。Cathepsin B是一种半胱氨酸蛋白酶，包括前体和具有酶活性的成熟体，前体在溶酶体中切割成熟，切割成熟的Cathepsin B主要存在于溶酶体中并可分泌到细胞外。结合以上实验结果，说明TAM吸收的葡萄糖通过HBP途径促进溶酶体OGT对Cathepsin B进行O-GlcNAcylation修饰。
图3 溶酶体OGT介导巨噬细胞Cathepsin B的S210 O-糖基化修饰
3. OGT介导Cathepsin B的O-GlcNAcylation可维持高水平的成熟体Cathepsin B
Cathepsin B作为TAM特异性高表达的组织蛋白酶，介导TME基质重塑，促进肿瘤侵袭。研究进一步利用巨噬细胞OGT条件性敲除小鼠，Cathepsin B S210A点突变表达质粒和订制的Cathepsin B S210-O-GlcNAc位点特异性抗体验证发现，缺失OGT介导的S210 O-GlcNAcylation修饰会导致成熟 Cathepsin B的水平显著减少。以上结果说明OGT介导Cathepsin B的O-GlcNAcylation可维持高水平的成熟体Cathepsin B。
图4 OGT介导Cathepsin B的O-GlcNAcylation可维持高水平的成熟体Cathepsin B
4. TAM分泌的Cathepsin B促进肿瘤细胞的侵袭转移和化疗抵抗
前期的研究结果表明， CTSB作为TAM特异性高表达的组织蛋白酶，介导TME基质重塑，促进肿瘤侵袭，而 TAMs 可能是 TME 中高水平 CTSB 的来源。该研究也的确观察到，与其他肿瘤细胞相比，巨噬细胞中 CTSB 表达量最高，且M2 样 TAMs 中 CTSB 表达最多。缺乏 OGT 的 M2 样巨噬细胞促进肿瘤细胞侵袭的能力较低，但当 CTSB 被抑制或敲除时，在细胞缺失 OGT 时不能进一步降低肿瘤细胞的侵袭；而在条件培养液中补充重组 CTSB 则可以挽救巨噬细胞中 OGT 缺乏导致的肿瘤细胞侵袭率的降低。
图5 OGT通过提高il -4极化Ms中成熟的CTSB促进肿瘤细胞侵袭
随后进一步利用体内实验探究了OGT 在小鼠体内促进肿瘤生长和转移的作用，发现发现巨噬细胞特异性缺乏 OGT 对体内肿瘤生长没有显著影响。然而，与对照组相比，巨噬细胞中 OGT 的缺失则可显著抑制肺转移，并可导致荷瘤小鼠的生存时间延长。此外，在切除原发肿瘤后，OGT 缺乏的荷瘤小鼠比对照组小鼠的生存率更高。这些结果表明，巨噬细胞中 OGT 丢失引起的肿瘤转移减少可以延长荷瘤小鼠的生存期。
图6 TAM摄取的葡萄糖通过促进Cathepsin B的O-GlcNAcylation修饰和成熟，进而促进肿瘤的侵袭和肺转移
已有报道表明巨噬细胞分泌的Cathepsin B可介导肿瘤细胞化疗抵抗，研究团队进一步深入研究发现，葡萄糖代谢以OGT和Cathepsin B依赖的方式促进肿瘤细胞抵抗化疗药物紫杉醇和奥沙利铂诱导的细胞死亡。且OGT以Cathepsin B依赖的方式促进小鼠皮下B16黑色素瘤、MC38移植瘤的化疗抵抗。此外该研究还分析了55例接受新辅助化疗的结肠癌 (CRC) 患者的肿瘤样本发现，TAM中 OGT表达与TME中Cathepsin B的表达显著正相关，且OGT和Cathepsin B的表达都与化疗疗效和化疗后的生存期显著负相关。这些结果表明，TAMs 中的 OGT 通过促进 CTSB 的成熟而产生化疗耐药。
图7 TAMs 中的 OGT 通过促进 CTSB 的成熟而产生化疗耐药
综上所述，在这项研究中发现，TME 中的 TAMs，尤其是 M2 样巨噬细胞，具有较高的葡萄糖摄取和利用能力，葡萄糖摄取增加可增强己糖胺生物合成途径 (HBP) 的活性，增强 TAMs 中组织蛋白酶 B 的成熟及其在 TME 中的分泌，从而促进肿瘤转移和化疗耐药，以此揭示了 TAMs 中葡萄糖利用的生物学和临床意义。
此外，研究还表明，除了促进肿瘤转移和化疗耐药外，巨噬细胞 M2 极化过程中葡萄糖摄取促进的蛋白 O-GlcNAc 糖基化修饰可能在建立 M2 样巨噬细胞的细胞特异性功能中发挥更重要的作用，而不仅仅局限于肿瘤免疫。本研究涉及的蛋白质组学数据也为未来研究 O-糖基化修饰在慢性病原体感染和疾病进展中，对建立巨噬细胞的功能特征和调节免疫细胞亚群的作用提供了线索。
图8 研究机制图解
基础医学研究所曹雪涛院士和海军军医大学医学免疫学国家重点实验室张迁教授为论文的共同通讯作者，基础医学院博士后史青竹和海军军医大学医学免疫学国家重点实验室沈奇骢副教授为论文的共同第一作者。
景杰生物可提供基于质谱的O-糖基化修饰组学技术，以及O-糖基化修饰抗体 (PTM-952，PTM-951RM)，助力生物标志物发现和疾病致病机理等研究。
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参考文献
