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Cell Death Dis | 赵寅/李璐团队磷酸化修饰组揭示TBK1影响视网膜血管发育及功能新机制
血-视网膜屏障功能障碍是众多致盲性眼病的早期病理改变，在糖尿病视网膜病变、老年性黄斑变性等常见眼病的发生与进展过程中均发挥关键作用。作为血-视网膜内屏障的核心组分，内皮细胞及其细胞间连接对于维持良好的血管屏障功能至关重要。
TANK结合激酶1 (TBK1) 是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，介导抗病毒免疫应答、炎症信号级联等反应，广泛参与调控炎症、肿瘤、自噬等病理生理进程，与多种疾病的发生发展密切相关。此外，有研究表明TBK1基因调控内皮细胞的增殖与成管能力。然而其是否参与内皮细胞屏障功能的维持目前尚未可知。
2022年10月28日，华中科技大学同济医学院附属同济医院眼科赵寅助理研究员与无锡市第二人民医院眼科李璐副主任医师团队在Cell Death Discovery发表了题为“Endothelial deletion of TBK1 contributes to BRB dysfunction via CXCR4 phosphorylation suppression” 的研究成果，文章阐明了内皮细胞中TBK1蛋白对于视网膜血管发育与血管屏障功能的保护作用，运用磷酸化修饰组学揭示了这一作用是通过TBK1介导的CXCR4的磷酸化修饰来实现的。景杰生物为该研究提供了蛋白质组及磷酸化修饰组学分析技术支持。
1.内皮细胞特异性敲除TBK1阻碍视网膜血管发育与血-视网膜内屏障的建立
研究者分别取出生后3天、5天、7天、18天及成年期内皮细胞特异性TBK1敲除鼠与相应对照鼠的视网膜组织，检测视网膜血管的径向生长、分支点数量、血管密度、血管通透性等参数。结果发现，内皮细胞缺失TBK1蛋白抑制视网膜血管发育，导致血管密度降低、分支减少，但不影响视网膜血管的径向出芽生长。不仅如此，内皮细胞TBK1敲除鼠的血管稳定性显著下降，出现血管退化及血-视网膜内屏障功能障碍。
图2 内皮细胞特异性敲除TBK1影响视网膜血管稳定性及血-视网膜内屏障功能
2.应用磷酸化修饰组学找到调控内皮屏障功能的TBK1下游靶基因CXCR4
联合运用磷酸化修饰组学与全蛋白质组学分析内皮细胞TBK1敲除组及对照组新生鼠视网膜组织中蛋白质磷酸化水平的差异。相较于对照组，实验组内检测到20个磷酸化修饰上调位点与104个磷酸化修饰下调位点。将磷酸化水平差异蛋白进行GO与KEGG富集分析，结合蛋白功能及组间磷酸化差异水平，选定磷酸化修饰下调蛋白CXCR4为TBK1调控内皮屏障功能的潜在靶点。
图3 分析内皮细胞TBK1敲除组及对照组新生鼠视网膜组织中蛋白质磷酸化水平的差异
3.验证TBK1通过介导CXCR4磷酸化调控内皮屏障功能
在视网膜组织及内皮细胞中验证沉默TBK1显著下调CXCR4磷酸化水平，且阐明了CXCR4 丝氨酸355位点 (S355) 是TBK1磷酸化作用位点。不仅如此，研究证实补充S355磷酸化CXCR4蛋白可以逆转沉默TBK1导致的内皮细胞间连接结构紊乱，改善内皮细胞屏障功能。
图 4 上：沉默TBK1显著下调CXCR4磷酸化水平；下：CXCR4 S355磷酸化参与调控内皮细胞屏障功能综上所述，内皮细胞敲除TBK1影响视网膜血管发育与血-视网膜内屏障功能，应用磷酸化修饰组学分析与实验验证阐明CXCR4 S355磷酸化参与TBK1介导的内皮屏障功能的调控，本研究为视网膜血管屏障功能障碍的发病机制与治疗思路提供新的理论支持。
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参考文献
1. Bowen Zhao, et al. Endothelial CYP2J2 overexpression restores the BRB via METTL3-mediated ANXA1 upregulation. FASEB J.
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