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Dev Cell | 南方医科大学白晓春/邹志鹏团队4D蛋白质组学揭示溶酶体调控间充质干细胞成骨分化的机制
间充质干细胞 (mesenchymal stem cells, MSCs) 是一类多能干细胞，具有自我更新和多向分化的能力。在一定的诱导条件下它可以分化为骨祖细胞或其他祖细胞，如前脂肪细胞和前软骨细胞，最终形成骨、骨髓脂肪或软骨组织，该过程受到了信号通路的严格调控。溶酶体在传统意义上是细胞内处理和回收废弃物质的“垃圾桶”，但近期研究显示其还是细胞的动态信号中枢，参与多种生物过程的调控。然而溶酶体在MSCs分化中的作用和潜在机制尚不清楚。
研究人员对经过3天成骨 (osteoblast，OB) 分化诱导的C3H10T1/2 MSCs细胞进行RNA-seq分析，发现许多溶酶体相关基因显著上调。此外，MSCs的溶酶体标志物LAMP-2A (CMA特异性受体) 显著上调，而巨自噬和溶酶体生物发生的标志物水平无明显改变。随着LAMP-2A水平的增加，MSCs在OB分化过程中产生了更多、活性更高的CMA溶酶体，因此，CMA溶酶体能促进MSCs的早期成骨分化，随后他们还证明CMA溶酶体抑制了MSCs的脂肪和软骨分化。
图1 CMA溶酶体对MSCs的成骨分化至关重要
02 Vangl2调控LAMP-2A表达和CMA活性
衰老过程中的成骨分化受损会引起LAMP-2A水平下调，为了明确LAMP-2A调节OB分化的分子机制，研究人员通过iTRAQ-LC-MS/MS蛋白质组学方法分析了16个月小鼠 (老年小鼠) 与3个月小鼠 (年轻小鼠) 股骨远端的差异表达蛋白，发现Vangl2 (平面细胞极性PCP的关键调节因子) 的表达在OB分化过程中上调超过3倍，这表明Vangl2可能是MSC分化的关键调节因子。后续研究进一步证实Vangl2可抑制LAMP-2A表达，降低CMA溶酶体的数量和活性，进而负调控MSCs的OB分化，抑制骨形成。
图2 Vangl2抑制MSCs中的LAMP-2A表达和CMA活性
03 Vangl2与LAMP-2A在溶酶体DRM共定位
为了探究Vangl2调控LAMP-2A的分子机制，研究人员分析了Vangl2在MSCs的亚细胞定位，结果发现在未分化的MSCs中，Vangl2主要定位于LAMP-2A+溶酶体/晚期内体，且大部分Vangl2与GM-1神经节苷脂 (抗去垢剂结构域DRM的标志物) 共定位，即Vangl2高度富集于CMA溶酶体膜的脂筏中，研究进一步发现Vangl2能结合LAMP-2A并将后者锚定在这些脂筏中，促使其被组织蛋白酶A降解，从而自我限制此类溶酶体的CMA活性。
图3 Vangl2与LAMP-2A在溶酶体DRM共定位
04 Vangl2-LAMP-2A协同清除多种关键成骨抑制因子
为了进一步探索Vangl2-LAMP-2A信号通路介导的CMA溶酶体对OB分化的调控机制，研究人员运用4D蛋白质组学技术分析了Vangl2敲低引起的组学改变，最后鉴定到下调至少2倍的52种蛋白质，其中40种蛋白质存在LAMP-2A识别的KFERQ序列，它们可能是CMA溶酶体的潜在靶标。随后，研究人员筛选出一些关键的成骨抑制分子，如成脂和成软骨分化的关键因子TLE3、ZNF423和SOX9，研究发现它们在成骨分化过程中被逐渐降解，从而清除了MSCs通往OB道路上的“障碍”。这些证据表明Vangl2-LAMP-2A介导的CMA溶酶体可选择性地降解多种关键成骨抑制因子，实现MSCs分化重编程，促进成骨分化。
图4 Vangl2-LAMP-2A协同清除多种关键成骨抑制因子
综上所述，该研究通过蛋白质组学分析阐述了溶酶体在MSC多向分化中的关键作用，首次揭示了Vangl2独立于PCP信号通路的重要功能，阐明了Vangl2-LAMP-2A信号通路自限CMA溶酶体活性的重要功能，也提示通过基因编辑等方法精确控制Vangl2的表达及CMA溶酶体活性，可能为利用间充质干细胞防治骨质疏松、骨缺损及骨代谢失衡等相关疾病提供潜在策略。
图5 研究机制图解
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参考文献
1. Yan Gong, et al. 2021. Vangl2 limits chaperone mediated autophagy to balance osteogenic differentiation in mesenchymal stem cells. Developmental Cell.
