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Dev Cell | 溶酶体蛋白质组学揭示NPC1/mTORC1在C型尼曼匹克病中的致病机制

精准医学与蛋白组学

2020.12.25

景杰学术 | 报道

题目：NPC1-mTORC1 Signaling Couples Cholesterol Sensing to Organelle Homeostasis and Is a Targetable Pathway in Niemann-Pick Type C

发表时间：2020年12月7日

期刊：Development Cell

影响因子：10.092

作者及单位：加利福尼亚大学伯克利分校的Roberto Zoncu教授团队

主要结论：系统阐明NPC1、mTORC1引起NPC溶酶体功能异常的分子功能以及两者间上下游关系，同时发现mTOR抑制剂对NPC溶酶体的积极疗效。

溶酶体 (lysosome) 是真核细胞中由单层脂蛋白膜包绕的富含一系列多功能酸性水解酶的细胞器。它一方面可以通过自噬作用及时分解多余或受损的细胞组分 (蛋白质、核酸、多糖等生物大分子) 发挥“清道夫”功能，另一方面，它也是分配机体胆固醇的重要“分拣站”：生理条件下，两种溶酶体胆固醇转运载体蛋白——位于溶酶体限界膜 (limiting membrane) 的NPC1及溶酶体腔 (lumen) 的NPC2——互相协作将溶酶体内的胆固醇转运至内质网、高尔基体、细胞膜等部位发挥生物学功能，在调控细胞内胆固醇的代谢平衡中起到了重要作用。不仅如此，近期研究表明，胆固醇可结合并激活细胞内关键的生长信号调控分子 —— mTORC1 (mammalian target of rapamycin complex 1)，促进脂肪合成、细胞增殖相关基因的表达，抑制自噬，从而促进细胞生长；而NPC1则可以通过干扰胆固醇与mTORC1的结合过程，防止mTORC1信号通路的持续性激活。

在NPC1和/或NPC2功能异常引起的罕见遗传病 —— C型尼曼匹克病 (Niemann-Pick type C, NPC) 中，细胞内游离胆固醇转运缺陷，使得大量胆固醇异常堆积于溶酶体 (限界膜/腔) 内。这不仅直接损害了溶酶体的正常分解代谢功能，并且还导致了mTORC1信号的过度激活，继而通过下游多种分子机制，引起细胞生长、脂质代谢等细胞功能的调节异常。更重要的是，考虑到mTORC1信号也在细胞器蛋白质稳态调控过程中发挥重要作用，这是否又会在很大程度上加速溶酶体等相关细胞器的功能受损进程仍是未知。因此，详细而准确地阐明NPC1、mTORC1信号在NPC发病过程中扮演的具体角色变得十分有必要。

近日，加利福尼亚大学伯克利分校的Roberto Zoncu教授团队，在发育学领域著名期刊Development Cell 上，发表了最新研究长文 [1]。他们在HEK293T、MEFs、iPSC起源的神经元细胞等体外细胞系中，整合利用蛋白质组学、CRISPR/Cas9、溶酶体免疫富集等实验技术，全面分析了NPC1对溶酶体功能及mTORC1活性的影响，并且检验了mTOR抑制剂Torin1对NPC溶酶体的治疗效果。

一、NPC1的缺失导致溶酶体水解蛋白质的功能明显受损

为了阐明NPC中溶酶体功能紊乱的分子机制，研究人员首先在正常 (sgNT) 以及NPC1缺失 (sgNPC1) 的HEK293T细胞（样本策略）中，通过免疫富集的方式纯化溶酶体 (lyso-IP) ，并利用非标记 (label-free) 定量蛋白质组学技术（质谱策略），比较了两组溶酶体蛋白质表达量的差异，同时，观察了广谱水解酶抑制剂亮抑酶肽和抑肽素 (leupeptin and pepstatin, L+P) 对溶酶体蛋白质含量的影响。与sgNT相比，在sgNPC1中，许多水解酶的含量明显降低，其中包括CTSZ, LIPA以及其他参与多糖、鞘磷脂降解的蛋白质，比如GALC和NAGLU等；并且，NPC溶酶体 (sgNPC1) 中蓄积了大量水解酶的底物蛋白以及介导自噬的接头蛋白，比如LC3, p62/SQSTM1, TAX1BP1, NCOA4等；而水解酶抑制剂对sgNPC1中底物蛋白含量增加的效应也较弱 (图1)。以上结果共同证明，NPC溶酶体的蛋白质水解功能严重受损。

图1 NPC1缺失的溶酶体降解功能降低

二、NPC1的缺失造成溶酶体膜对损伤更敏感

已有研究表明，未被降解的底物蓄积于溶酶体腔内会导致溶酶体膜对损伤更敏感。在本次研究中，研究人员也对NPC溶酶体膜的损伤情况进行了评估。通常情况下，受损的溶酶体膜可以通过 Ⅲ 型转运必需内体分选复合物 (endosomal sorting complex required for transport, ESCRT) 以聚合反应形式进行修复，而蛋白质组学的结果则表明，在NPC溶酶体中，Ⅲ 型ESCRT亚基CHMP1A和IST1，以及负责招募ESCRT的ALIX/ PDCD6IP都呈现出了明显富集现象 (图2)。不仅如此，通过免疫印迹和免疫荧光实验，研究人员也进一步验证了NPC溶酶体中ESCRT复合物蛋白表达量增加的现象 (图2)。此外，当暴露于溶酶体去稳定剂L-亮氨酰-L-亮氨酸甲酯 (LLOMe) 后，与正常组相比，NPC溶酶体膜也表现出了更加严重的损伤现象 (图2)。这些证据提示，NPC溶酶体膜不仅存在持续性地损伤修复，并且其对损伤刺激也更加敏感。

图2 NPC溶酶体膜出现严重损伤

三、NPC1通过其胆固醇转运功能调节mTORC1活性

随后，为了阐明上述NPC溶酶体中NPC1功能缺陷与mTORC1信号的内在联系，研究人员检测了多种具有胆固醇转运缺陷的NPC1对mTORC1活性的影响。其中，具有NPC2结合缺陷的NPC1^F503/504A 以及具有胆固醇结合缺陷的NPC1^P202/203A和NPC1^P691S，即使是在溶酶体内含有胆固醇的情况下，都无法恢复异常激活的mTORC1活性 (图3)。与此一致的是，具有胆固醇转运缺陷的NPC1也丧失了响应胆固醇浓度并调节mTORC1在溶酶体膜上定位的能力 (图3)。以上结果表明，NPC1的胆固醇转运功能对调节溶酶体功能以及mTORC1活性至关重要。

图3 溶酶体NPC1功能缺陷对mTORC1活性的影响

四、NPC1通过其胆固醇转运功能调节mTORC1活性

理论上mTORC1的异常激活会导致胆固醇等脂类物质的合成增加，的确，在利用Filipin 和mCherry-D4H*调查溶酶体中脂质含量时，研究人员发现，NPC溶酶体中胆固醇和鞘脂类的含量都比正常溶酶体高 (图4)。但值得注意的是，高选择性的ATP竞争性mTOR抑制剂Torin1却无法抑制NPC溶酶体中的脂质积累现象 (图4)。这也提示，NPC溶酶体中，mTORC1的活性异常升高是胆固醇等脂质积累的结果，并非是导致后者的主要原因。另一方面，研究人员也观察到，Torin1和LAMTOR5 (late endosomal/lysosomal adaptor, MAPK and mTOR activator 5) shRNA都可以加强NPC溶酶体的自噬作用以及蛋白质降解功能 (图4)。与此同时，Torin1也降低了NPC溶酶体膜上 Ⅲ 型ESCRT亚基的募集，起到了缓解溶酶体膜损伤的作用 (图4)。这些证据共同表明，在NPC溶酶体中，NPC1功能缺失导致的胆固醇转运功能受损是mTORC1活性异常的上游分子事件，后者又引起了溶酶体蛋白水解功能降低、膜损伤加剧等负面效应。

图4 抑制mTORC1可缓解NPC溶酶体功能受损的现象

小结与展望

综上所述，本研究中结合蛋白质组学等多种实验技术，在系统阐明NPC1、mTORC1引起NPC溶酶体功能异常过程中的分子功能以及两者间上下游关系的同时，惊喜地发现了mTOR抑制剂对NPC溶酶体的积极疗效。考虑到mTOR抑制剂已在多种癌症的治疗中取得成功，此项研究成果若能向临床应用成功转化，必将会在很大程度上为NPC，甚至是其他溶酶体病的治疗带来更多希望。

图5 NPC1功能缺失导致mTORC1异常激活以及溶酶体功能受损

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参考文献：

1. Oliver B. Davis, et al., 2020. NPC1-mTORC1 Signaling Couples Cholesterol Sensing to Organelle Homeostasis and Is a Targetable Pathway in Niemann-Pick Type C. Development Cell.

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