上海吉凯基因医学科技股份有限公司

分析测试百科网 > 行业资讯 > 微信文章

【糖尿病合集第一弹】BD Rhapsody单细胞助力解析冠心病和糖尿病中的性别差异机制

吉凯基因

2023.1.04

BD Rhapsody单细胞

助力解析冠心病和糖尿病中的性别差异机制

>>糖尿病合集>>糖尿病合集>>糖尿病合集>>

前言

尽管人们已经认识到男性和糖尿病（DM）是冠心病（CAD）的风险因素，但它们之间的内在联系尚不完全清楚。DM会加速动脉粥样硬化病变的进展，甚至在胆固醇降低后导致斑块重构异常。被批准用于糖尿病降糖的新型药物也可以降低心血管疾病发生，但其中的机制并不能用血糖降低来解释。有意思的是，女性在绝经前患心血管疾病的风险很小，绝经之后患病风险逐渐和男性持平，但这种在心血管疾病和CAD中的性别差异表现具体原因尚不清楚。越来越多的证据表明，在心血管疾病发生过程中，T细胞起到关键性的驱动和修饰作用，CD4⁺ T细胞常见于动脉粥样硬化斑块中。而在成人中，性别差异会使淋巴细胞亚群发生明显差异。

2022年8月30日，美国拉霍亚免疫学研究所的研究人员在International Journal of Molecular Sciences（IF=5.542）在线发表题为“Sex differences in coronary artery disease and diabetes revealed by scRNA-Seq and CITE-Seq of human CD4⁺ T cells”论文。研究人员收集了61位冠心病患者及使用心导管检查以排除冠心病的受试者的血液，利用BD Rhapsody Scanner去检测细胞的活性和数目，接下来使用51种BD Abseq抗体对细胞进行标记，最后使用BD Sample Multiplexing Kit进行单细胞混样检测分析。研究人员根据是否患有DM和冠心病以及性别对检测对象进行了区分，一共检测了41,782个CD4⁺ T细胞的转录组。结果发现CAD和DM的CD4⁺ T细胞基因表达谱和通路有很多相似的地方，这表明CD4⁺ T在两种疾病中可能有类似的作用机制。另外男性和女性，患有DM及未患有DM的CD4⁺ T细胞基因表达谱式有明显差异。

单细胞测序相关平台与应用

BD Rhapsody单细胞分析平台

BD Abseq寡核苷酸偶联抗体

BD Sample Multiplexing Kit

Seven Bridges Genomics pipeline

实验结果

鉴定不同患者的CD4⁺ T细胞类群

研究人员对61名42-78岁的参与者进行了CD4⁺ T细胞测序，其中有17名合并/不合并CAD的糖尿病男性，17名合并/不合并CAD的非糖尿病男性，16名患/不患CAD的女性，其中9名患DM，7名不患DM。研究人员将CD19⁻, CD3⁺, CD4⁺, and CD8⁻ 的细胞定义为CD4⁺ T细胞并进行测序分析。结果发现鉴定到了17种不同细胞簇，其中cluster 9可能是CD4⁺ T细胞和骨髓细胞的混合。剩下的16种细胞簇中，作者根据表面marker的信息鉴定出了Thone，Th2，Tfh和Treg细胞群，剩下的细胞簇中鉴定出中心记忆和效应记忆T细胞群。Cluster15被鉴定为终末分化效应记忆细胞，Cluster 12 是 MMP9阳性细胞，而 cluster 16则是 PDCD1阳性细胞。

Figure1. CD4+ T细胞分群

CD4⁺T细胞转录组分析

接下来，作者进行了转录组分析，分析了每个细胞群与其他细胞群相比较的基因表达差异。结果发现有些CD4⁺ T细胞具有细胞毒性，高表达一些毒性基因，比如说cluster7和cluster2。Cluster17高表达Treg的特征基因，cluster8高表达CCR2和CCR6，说明这群细胞中可能含有Th17细胞。Cluster1和14是两群表达类似基因谱式的naïve细胞群。Cluster5是表达CXCR5的Tfh细胞，而cluster1,6,14都低表达KLRB1。为了了解这些CD4⁺T细胞群是如何联系的，作者还使用Monocle3进行了轨迹分析。

Figure2. CD4⁺ T细胞群差异分析及轨迹分析

CD4⁺ T细胞亚群丰度

作者为了探究DM，CAD和性别是否会影响CD4⁺ T细胞亚群的丰度，比较了每种亚群的细胞数量。结果发现CAD患者的CCR2⁺效应记忆CD4⁺ T细胞比不患CAD的细胞比例显著降低，CCR2参与了Treg细胞招募，但这种作用在动脉粥样硬化中尚未被证实。女性这群细胞也比男性的显著降低。

DM患者的MM9⁺ CD4⁺ T细胞显著升高，这类细胞在女性中含量显著减少。PDL1⁺效应记忆CD4⁺ T细胞在男性中的比例显著上升。CD4T^-C15在患有CAD的女性中显著减少，CD4T^-C16在患有CAD和DM的男性中增加。有趣的是，Cluster14只在不患DM的男性中出现。Treg细胞群在各类患者中的比例没有明显区别。

Figure3. CAD和DM男性女性患者CD4⁺ T细胞亚群比例

不同疾病中差异表达基因分析

CAD患者的所有CD4⁺ T细胞中，包括TCF7，LTB和GNAI2等基因表达上调。DM患者中，除了LAIR2和IFITM3之外，也观察到TCF7和GNAI2的表达上调。TCF7在之前的报道中发现与DM相关，可能会影响β细胞功能。作者发现TCF7在CAD患者的CD4⁺ T细胞中过表达，这在之前尚未有人报道。GNIA2可以表达与趋化因子受体信号相关的蛋白，可能介导Hippo/Yap依赖的DM加速的动脉粥样硬化。动脉粥样硬化相关基因IL32在DM患者中表达下调。除此之外，作者在CAD和DM中发现了共同显著上调的31个基因。

Figure 4. CAD和DM患者的差异基因分析

CD4⁺ T细胞通路分析

在CAD和DM患者中，包括“Th1”和“NFAT在免疫应答和T细胞受体信号中的作用”等信号通路都在CD4⁺ T细胞中表达上调。CAD患者中富集到了NFAT信号通路，说明NFAT可能在动脉粥样硬化中起到作用。在CAD患者中，“细胞毒性T淋巴细胞介导的靶细胞凋亡”通路上调，“T细胞衰竭信号”通路表达下调。在DM患者中，“IL-8信号”，“整合素信号”，“Ephrin受体信号”等通路特异性上调。

作者还进一步分析了性别差异是否会对信号通路有影响，结果发现许多包括CD52, JUNB, IFITM3和 SLC2A3在女性中高表达，而这些高表达基因可以富集Th2, Th1, IL-7和干扰素信号通路。而在男性中，只有p53和凋亡信号通路高表达。

Figure 5. CD4⁺ T细胞通路分析

CD4⁺T随机森林分析

为了鉴定出可以充分区分不同疾病组的基因，作者使用了随机森林机器学习方法。结果发现，TCF7可以充分区分CAD和非CAD患者，S100A9在DM患者中是更重要的标志，而IFITM3, FOSB和CCL5则在非DM对象中更为重要。

接下来，作者分别研究了男性和女性CAD的驱动基因。有趣的是，TCF7在男性CAD患者中非常重要，但在女性CAD患者中却并非如此。IFITM3在女性中是最重要的区分CAD的基因，但在男性中只排序到50位。作者对相关基因进行排序，结果发现TCF7, LTB和 GNAI2在男性中更重要，而IFITM2, IFITM3和SORL1在女性中更重要。

Figure 6. 随机森林分析鉴定区分不同疾病的基因

相互作用分析

T细胞与骨髓细胞之间的相互作用在抗原呈递过程中起到重要作用，作者接下来进一步分析了CD4⁺ T细胞群与骨髓细胞的相互作用。结果发现CAD患者所有的CD4⁺T细胞群均有LGALS9-CD44相互作用，DM患者除了cluster14也有这种相互作用。CAD和DM患者中大约半数CD4⁺ T细胞群表现出SELL与SELPLG的相互作用，并且SELL-SELPLG相互作用在男性患者中更加明显。LGALS9-CD44相互作用在男性和女性中没有明显差异。Tregs细胞群中表现特异性CTLA4-CD86相互作用。

Figure 7. CD4⁺ T细胞与骨髓细胞的相互作用分析

总结与展望

在之前的报道中，冠状动脉疾病及其并发症，包括心肌梗死，在男性和女性中的表现是不同的。但性别差异对CAD的免疫细胞的影响却知之甚少，在这篇文章中，作者利用碧迪医疗单细胞平台分别对CAD男性和女性患者的CD4⁺ T细胞进行了单细胞测序和分析，结果发现性别不同CD4⁺T表达谱有很大差异。同时通过对CD4⁺ T细胞的单细胞测序鉴定了一些可以指征CAD和DM的标志物。另外，CAD和DM的CD4⁺ T细胞基因表达谱和通路有很多相似的地方，这表明CD4⁺ T在两种疾病中可能有类似的作用机制。这些数据揭示了性别差异在CAD中表现不同的可能机制，也为DM和CAD的联系提供了线索。