浙江大学药学院高建青团队构建ROS滤网包裹的双层凝胶体系携载3D间充质干细胞球用于脊髓损伤的双时期调控

吉凯基因

2023.4.19

研究背景

脊髓在中枢神经系统中负责大脑和机体各器官之间神经信号的传导，而撞击、跌落等因素引起的脊髓损伤（SCI）可导致器官功能失常、瘫痪甚至死亡，且伴随大量生理性和心理性的并发症。SCI病情复杂，预后较差，且临床上缺乏有效的治疗手段。在损伤后，SCI的病理进程可分为急性期和慢性期。其中，在急性期，脊髓损伤部位发生组织坏死、水肿、出血，并快速募集炎症细胞，大量释放炎症因子和活性氧，造成恶劣的炎症微环境，进而导致脊髓二次损伤，扩大损伤区域和加剧损伤程度。而在慢性期，激活的星形胶质细胞和小胶细胞等逐渐形成致密的胶质瘢痕，再加上人体神经有限的再生能力，脊髓神经无法再生和重塑，导致机体功能恢复不佳。因此，根据SCI在急性期和慢性期的不同特点，对其实行双时期的调控具有重要意义。

2023年3月2日，浙江大学药学院高建青教授团队在Chemical Engineering Journal上发表题为ROS filter coating scaffold protects 3D mesenchymal stem cell spheroids for dual-phase treatment of spinal cord injury的研究。该研究构建了一种ROS滤网包裹的双层凝胶体系携载3D间充质干细胞球（RF-pGel-MS）用于SCI的双时期调控，并在SCI大鼠模型上获得较好的运动学和组织学恢复。

研究内容

1. RF-pGel-MS的构建和表征

为了构建RF-pGel-MS，本研究首先通过合成两端连接ROS响应的苯硼酸基团的化合物TPA，并与聚乙烯醇（PVA）发生交联即可得到具有ROS清除能力的ROS滤网，RF；将多孔GelMA溶液进行紫外交联即可得到具有疏松多孔结构，并可携载MSC细胞球（MS）的凝胶，pGel；通过低粘附培养法对MSC三维培养即可得到球状的MS。最后，将MS通过共交联的方式携载入pGel中。RF包裹在pGel-MS的外围即可得到最终的RF-pGel-MS。扫描电镜显示，RF呈现致密的凝胶网络结构。内部的pGel则呈现疏松多孔的凝胶网络结构，有利于细胞在里面的存活。而MS则呈现致密的球形结构，表面可见规则排列的MSC。

2. MS旁分泌效应和神经滋养能力考察

ELISA检测细胞分泌水平以及PC12分化实验表明，MS相比同等细胞数量的MSC，具备更强的旁分泌功能，可分泌更高水平的血管生长因子（VEGF）、神经生长因子（NGF）和胶质来源神经滋养因子（GDNF），且能更加显著地促进PC12类神经细胞的分化和轴突的延伸。这得益于MS的三维空间结构，可更好地拟合MSC的体内状态和活性。有趣的是，本研究发现不同尺寸的MS的旁分泌水平和神经滋养也存在一定的不同，相比之下，尺寸较小的MS2和MS3表现更佳。

3. RF-pGel-MS抗ROS能力考察

在体外实验中，外层的RF可快速清除过氧化氢，并以ROS响应性的方式降解。RF不仅有效保护PC12细胞，降低其胞内ROS水平，还可保护内部携载的MS免受过氧化损伤。通过完全切断脊髓的方式成功在SD大鼠上建立SCI模型。通过局部埋置的方式将RF-pGel-MS植入到损伤处进行体内考察。在急性期，RF-pGel-MS可显著降低脊髓组织中DNA和脂质过氧化产物4-HNE、8-OHdG的水平。另外，本研究采用慢病毒转染的方式使MSC表达GFP，并将得到的GFP-MSC用于MS的体内示踪。结果表明，MS在RF的保护下，在植入体内后第4天仍可保持完整的形态。

4. RF-pGel-MS长期疗效考察

将RF-pGel-MS植入到SCI大鼠中，考察大鼠术后5周的功能学和组织学恢复。各组模型大鼠在术后第1周均有体重下降现象，但在后续总体保持平稳，说明植入的凝胶体系无明显的毒性。BBB评分结果表明，各组大鼠在术后5周均有一定的恢复。而RF-pGel-MS可明显改善SCI大鼠的后肢运动能力，该组大鼠可观察到大幅的踝关节活动，偶见负重行走动作。在第5周，本研究在大鼠后肢植入电极，并使用金属点对后肢各关节进行标记，在Vicon成像系统的帮助下可直观地观察到大鼠后肢运动过程中各关节高度和角度变化以及腿部肌肉肌电信号变化。结果表明，经RF-pGel-MS治疗后，大鼠后肢运动具有更大幅度的关节角度和高度变化，肌电信号在频率和幅度上也显著提升。最后，组织学考察表明，RF-pGel-MS可促进神经的再生和神经纤维的延伸。

研究总结

1. 针对SCI急性期和慢性期不同特点和需求，构建了一种集ROS清除、干细胞疗法为一体的双层凝胶体系，RF-pGel-MS。

2. RF可快速清除ROS，降低组织的过氧化损伤和减缓二次损伤，并保护支架体系的MS，提高其植入后的生存率。

3. 具有3D结构的MS可拟合MSC的体内状态，相比2D结构的MSC具有更强的旁分泌效应和神经滋养效果。

综上所述，该双层凝胶体系有望为SCI双时期调控治疗提供新的思路。

吉凯助力

本研究采用了吉凯基因公司GFP-转染慢病毒产品用于MSC的荧光标记，助力高水平的科学研究。经过慢病毒转染和嘌呤霉素筛选的GFP-MSC可持续扩增并稳定表达GFP荧光。

作者简介

本研究第一作者为浙江大学药学院博士研究生曹坚和吴佳禾博士后，通讯作者为浙江大学药学院高建青教授和天津医科大学总医院冯世庆教授。