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【客户案例】看凯莱英生物如何布局全球ADC药物研发与转化

沃特世

2023.9.07

凯莱英生物是凯莱英医药集团（股票代码：002821.SZ/6821.HK）战略新兴业务板块的核心业务，凯莱英生物致力于成为技术驱动、服务定制、质量卓越、效率优异、全面赋能的生物大分子CDMO一站式服务平台。为客户提供抗体和重组蛋白药物、偶联药物、质粒和mRNA、各类生物药制剂灌装、分析方法开发与检测服务以及国内外注册与申报等全方位、定制化、一站式的综合服务。

随着抗体偶联药物（Antibody-drug conjugates，ADC）赛道的热度持续攀升，其生产技术和工艺研发的高壁垒也催生了ADC研发企业对专业CDMO服务的旺盛需求。凯莱英分析测试中心独立承接裸抗、毒素、ADC药物原液（DS）、ADC药物成品（DP）的深度表征以及各类ADC药物质量属性的分析评价，部署了Waters ACQUITY Premier UPLC/Empower, Arc Premier HPLC/Empower, H-Class/Xevo G2-XS/UNIFI、BioAccord LC-MS系统/waters_connect等仪器和软件平台，为ADC项目提供强有力的分析技术支撑，赋能其全球合作伙伴ADC药物的研发布局。

图1.凯莱英生物分析测试中心。

ADC生产和分析需求不断攀升

ADC CMC面临着全方位挑战：复杂的偶联工艺涉及到载药量（DAR）、异质性（载药量分布）、free drug去除，偶联效率和工艺批间一致性等；并且抗体及ADC均需要制剂处方开发；分析方法开发面临的挑战也是严峻的，在ADC全开发流程中均需要分析方法开发和产品表征的支持，其分析检测工作量是单独抗体2倍以上。LC-MS在CQAs分析上具有广泛的适用性，可以满足多种CQAs分析表征和监测的需求。

图2. 安装在凯莱英生物分析测试平台的Waters BioAccord LC-MS系统。

ADC药物表征平台案例分享

凯莱英生物高效助力创新ADC药物的开发，分析测试中心建立了完整的质谱分析平台，与前沿技术偕行，致力于为业界提供高效、优质的一站式偶联药物CDMO服务，助力ADC项目研发创新，赋能企业ADC管线研发进程。目前已具备完善的Intact水平、亚基水平、肽段水平的多策略分析平台，能够对偶联分布、偶联位点、DAR、偶联位点占有率等进行正交分析，支持从研发、放行、稳定性检测等各类需求。

抗体偶联药物（ADC）由靶向特异性抗原的抗体（mAb）与有效载荷（细胞毒性药物, 以下简称Drug）通过连接子（Linker）共价偶联而成。相比单克隆抗体药物，其Drug偶联的随机性大大增加了ADC药物结构的复杂程度，因此往往需要在多个结构水平对ADC药物进行表征，以完善药品质量源于设计（Quality by Design，QbD）视角下ADC药物质量分析与控制。基于质谱分析等检测技术平台, 可从完整分子水平、亚基水平、肽段水平及高级结构四个方面进行ADC药物的结构表征。

完整分子水平

完整分子水平下的ADC药物分析，通常可以获得分子序列完整性及药物抗体偶联比（DAR）信息。Cys偶联的ADC药物，完整分子水平下最常用的分析手段是Native Mass（SEC-MS），此方法与传统RP-LC/MS相比，采用了可挥发性缓冲盐作为SEC的流动相，在不破坏分子链间非共价键作用力的情况下将ADC分子以整体状态送入质谱仪进行分析。如图2所示，通过Native Mass可以检测到药物组分中偶联不同数量Drug的分布，并通过各峰响应强度的百分比计算平均DAR值。

图3. 三种不同药物负荷水平的Cys偶联ADC样品的药物分布

LC-MS原始谱图（左），LC-MS原始谱图局部放大（中），解卷积后谱图（右）。

图4. 示例：LC-MS测定DAR及药物分布I。

图5. 示例：LC-MS测定DAR及药物分布II。

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亚基水平

亚基水平的ADC分析可以与其完整水平下的结果进行正交分析，除了DAR值信息外，亚基水平的结构表征还能获得轻重链的一级结构信息，最简单的亚基水平分析技术是通过RP-LC/MS进行还原分子量的检测。该方法需要将样品进行还原处理，在反相条件下分离并进行质谱数据采集。如图下图所示，通过反相液相方法进行分离，轻链、重链及它们偶联不同数量Drug的组分均得到良好分离，通过各峰响应强度百分比计算得到平均DAR值。

图6. Cys偶联的ADC药物RP-LC/MS 谱图a). LC-UV谱图，b). 解卷积后重链的LC-MS谱图，c). 解卷积后轻链的LC-MS谱图；Drug代表偶联载荷，“括号”内数字表示偶联数量。

肽段水平

肽段水平下的ADC药物分析，可通过还原/非还原肽图进行，从而获得ADC药物的蛋白氨基酸序列覆盖度、翻译后修饰、二硫键、偶联位点及位点占有率等信息。

序列覆盖度分析可以确认蛋白的序列，通过一种或多种蛋白酶分别酶切后的数据，实现样品中含有的蛋白氨基酸序列100%覆盖。

ADC药物在生产过程中可能会产生翻译后修饰，如氧化、脱酰胺等，进而其功能和免疫原性等受到潜在影响，因此在药物开发过程中必须得到准确的研究表征。一般来说，通过MS数据中原始肽段及对应修饰肽段的响应强度比值可以得到该修饰的发生比例；再进一步，MS/MS数据的分析可以确定修饰发生位点。通过还原/非还原肽图数据进行对比，结合二硫键理论连接方式及分子量可以对ADC二硫键连接方式进行确认，同时对二硫键错配的比例进行监测。

以上三种肽段水平的表征方法也是蛋白药物标准的常规结构表征内容，在生物药物分析中应用广泛。偶联位点及偶联位点占有率则是ADC等偶联类药物特有的表征项目，需要在ADC结构表征中特别关注。还原肽图分析在翻译后修饰分析中具有阐明位点特异性的能力，该方式也是鉴定偶联位点及偶联位点占有率最常用的手段。

图7. MS/MS图谱展示偶联位点。

图8. MS/MS数据用于偶联位点测定。

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高级结构表征

高级结构对蛋白类药物的功能至关重要，结构变化会影响其结合活性、药效性及药代动力学等。传统的蛋白质结构分析基于X射线衍射、冷冻电镜等技术，成本高昂。在蛋白药物的分析领域，圆二色谱（CD）及差示扫描量热法（DSC）是目前高级结构表征最常用的方法，CD通过远/近紫外区扫描光谱包含的信息对蛋白质高级定性，DSC通过蛋白受热变性的过程来监测高级结构的变化，这两项技术所呈现的结果是溶液中所有蛋白质的整体构象的平均结果，分辨率较低。

近年来，基于质谱的结构解析技术的发展使蛋白结构的精细解析成为可能，基于质谱的高级结构解析一般有化学交联、蛋白化学印迹、离子淌度、氢氘交换解析等技术。其中氢氘交换质谱为蛋白药物高级结构表征提供了相对成熟的平台和较好的分辨率，其原理是通过计算氘原子对肽段骨架上氢原子的取代速率的变化反应其蛋白结构的变化，通过不同空间结构下氢氘交换速率的差异来评估蛋白药物结构的相似性。如下图所示，两批次蛋白氘代率水平随时间变化趋势高度一致，说明其高级结构相似度很高。

图9. 两批次蛋白肽段氘化水平对比图；红线与蓝线分别代表两批次蛋白。

图10. 示例：HDX-MS用于Cystine偶联ADC高级结构表征。

mAb&ADC：从HDX-MS结果来看，90%的肽段没有差别，说明偶联小分子后对抗体本身的影响不大；
mAb&ADC&PR-mAb：从三者的HDX-MS对比结果显示，这两处的差异主要来源于链间二硫键的缺失，小分子药物对其结构影响不大。

仪器赋能

凯莱英生物主管级研究员殷薛飞博士评论说，BioAccord LC-MS这套系统有4个方面的优势，使其在CDMO分析平台中占有一席之地。

（▽点击可展开）

Waters BioAccord LC-MS系统不仅可以满足研发阶段的样品检测需求，配备waters_connect软件可以更方便的满足在GMP环境下的质谱分析需求，仪器和软件的自动化设置可以自动完成仪器状态的检查、校正等工作，降低了分析人员要求，对于CDMO来说能够更好地扩展质谱在质量控制部门的应用。

LC-MS在生物制药行业的普及率已经非常高了，几乎每一家企业都会至少在分析平台配置一台或几台LC-MS，但是目前LC-MS主要是应用于产品开发阶段，随着目前生物制药分子类型和结构复杂度的提升，传统的LC或CE等方法在个别质量属性分析上难以满足产品放行和稳定性研究的要求，LC-MS在QC逐渐展现出其优势，在QC的应用也越多越多。BioAccord满足了传统高分辨LC-MS在GMP环境中使用时对数据合规性的要求。

BioAccord不止是提供一个分析工具，更在于这是一个完整的LC-MS分析平台系统，可以给客户在生物药分析中经常涉及的工作流程，简化了方法设置、数据采集、数据处理和实验结果报告生成过程，可快速提供分析员所需的样品信息。

BioAccord虽然系统体积小，但能提供可靠稳定的质谱数据，其数据质量可以比拟传统的LC-MS仪器。这对分析复杂的高质量生物大分子，提供了坚实的基础。

展望未来

ADC药物的开发从起始物料、工艺开发到质量控制，会涉及化学和生物学等多学科参与，其分子结构和生产过程复杂多样，产品异质性高，且不同的ADC产品呈现出较大的差异，加上新的抗体形式、有效载荷、连接子以及新的偶联策略也在不断出现，使得每个ADC产品的生产工艺和控制策略都具有其个性化的特点。而随着ADC赛道愈发火热，其背后是越来越激烈的“抢跑”、“差异化”等竞争压力，研发企业对生产工艺、处方开发、质量研究和控制、稳定性等方面的要求更加严格，同样也会面临诸多挑战。

相较于蛋白类药物，ADC药物的结构复杂性和异质性更高，在适用于ADC分析的技术中，LC-MS是一种非常有价值的多功能工具。在过去几年中，越来越多的LC-MS策略在完整蛋白质、亚基、肽等水平上被开发，这对评估ADC药物的精细结构分析具有非常大的价值。

自BioAccord LC-MS系统在凯莱英生物安装以来，除了常规的蛋白药物、ADC药物表征，还建立了mRNA检测平台，聚焦mRNA Capping、PolyA 分布、Oligo Mass， Oligo Sequence等检测项目，目前平台已完成十余个项目的mRNA的分析方法开发和检测。2023年，BioAccord LC-MS系统安装完成了CSV验证，具备GMP检测的能力，在九月份完成了第一批GMP产品的放行检测，未来将承担更多项目的LC-MS放行检测，持续赋能客户对于mAb、ADC、RDC、mRNA等项目的开发需求。