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使用疏水填料TOYOPEARL PPG-600M纯化抗体药物偶联物
抗体药物偶联物 (ADCs) 由于具有高异质性，其纯化工艺十分复杂，主要挑战在于分离未结合的抗体和游离药物，以及确定药物/抗体结合比率 (DAR) 。
ADCs的疏水性比一般的单克隆抗体更强，是因为其有效载荷具有疏水性。DAR值的增加会使ADC的疏水性增强，利用该特点可通过疏水层析分离不同DAR值的ADC。
我们使用了疏水层析填料TOYOPEARL PPG-600M (65 μm) 对ADC模拟物进行了纯化研究。TOYOPEARL PPG-600M采用了相对亲水的配基，因此具有回收率高、结合能力强、pH范围宽等优点。
ADC模拟物的纯化
本研究中使用的抗体是Humira®阿达木单抗的生物类似药。ADC模拟物由荧光素-5-异硫氰酸酯通过赖氨酸基团与抗体进行异质、随机偶联而成。
将ADC模拟物进样至装填有TOYOPEARL PPG-600M填料的层析柱中，按低、中、高DAR值分离ADC模拟物片段（图1）。
图1. 使用70-80-100%B三步梯度法分离ADC模拟物
使用疏水色谱柱分析DAR
在TSKgel Butyl-NPR色谱柱上对每个洗脱步骤的洗脱溶液进行了分馏和分析，并计算UV-DAR估值（图2）。
图2. TOYOPEARL PPG-600M填料上ADC模拟物的吸光率差异及各个洗脱步骤的DAR估值
每个条形图上蓝色表示抗体的ADC模拟物的吸光率，红色表示FITC的ADC模拟物的吸光率。使用TSKgel Butyl-NPR色谱柱分析了分级梯度的片段。
结果与讨论
由于耦合的随机性和异质性，我们发现DAR值的变化范围较大，为0-6。因此，ADC的纯化过程也比定点ADC分离更为复杂。
尽管如此，TOYOPEARL PPG-600M填料在分级梯度中仍然具有足够高的选择性，能够将ADC偶联物按低、中、高三组不同的DAR进行分离。低DAR片段的DAR均值为1，中DAR片段为3，高DAR片段的DAR中值为5。
所有获批ADCs的DAR值均介于2-4之间。在分级梯度期间微调浓度，可以调整该过程以分理处目标DAR范围内ADCs。
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