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Dr.赛流式小课堂 | 流式还要封闭Fc受体？

赛默飞生命科学

2023.10.16

最近有很多同学都来问，流式实验中到底要不要做Fc受体封闭？

直接上答案，要！要！要！重要的事情说三遍。至于这背后的原因，请听我细细道来。

什么是Fc受体封闭？

提到Fc受体封闭，首先要弄清楚什么是Fc受体。Fc受体是一类表达在某些细胞比如粒细胞、B淋巴细胞、树突细胞、巨噬细胞及自然杀伤细胞等细胞表面的受体蛋白（图1）。Fc受体能够跟抗体的Fc段结合（图2），通过跟抗体的结合，Fc受体能够促进病原体、肿瘤细胞或者被感染细胞的清除（图3）。通过某种方式阻断Fc受体和抗体结合就叫做Fc受体封闭。

IgG是最常见的抗体类型，而能够跟IgG结合的Fc受体称为Fcγ受体，主要分为FcγRI (CD64)、FcγRIIa (CD32a)、FcγRIIb (CD32b)、FcγRIIc (CD32c)、FcγRIIIa (CD16a) 和FcγRIIIb (CD16b)。

图1. Fcγ受体的主要类型及其分布的细胞类型。+, 组成性表达; –, 不表达; #, 诱导性表达; *, 表达依赖于FCGR2C等位基因状态。图片出处：Bournazos, S., Gupta, A. & Ravetch, J.V. The role of IgG Fc receptors in antibody-dependent enhancement. Nat Rev Immunol 20, 633–643 (2020). https://doi.org/10.1038/s41577-020-00410-0.

图2. IgG抗体结构及其与Fc受体结合的示意图。图片出处：Barb AW. Fc γ receptor compositional heterogeneity: Considerations for immunotherapy development. J Biol Chem. 2021 Jan-Jun;296:100057. doi: 10.1074/jbc.REV120.013168.

图3. Fc受体通过与抗体结合促进病原体，肿瘤细胞或者被感染细胞的清除。图片出处：Kang TH, Jung ST. Boosting therapeutic potency of antibodies by taming Fc domain functions. Exp Mol Med. 2019 Nov 18;51(11):1-9. doi: 10.1038/s12276-019-0345-9.

为什么要做Fc受体封闭？

对于这个问题，相信同学们在了解了什么是Fc受体及其特性之后也能猜出大概。没错，我们使用的流式抗体能够通过Fc段与细胞上的Fc受体结合，这种结合对于我们的流式实验来说就是一种“非特异性”的结合，会造成高背景和假阳性等问题。

在图4中，我们将未经Fc受体封闭和经过Fc受体封闭的THP-1细胞（人源单核细胞系）进行Anti-mouse IgG2aκ Isotype Control (APC)染色，发现未经Fc受体封闭的细胞有明显的假阳性信号（紫线），而Fc受体封闭能够有效的消除这部分信号（蓝线）。灰线代表未封闭也未染色细胞的自发荧光信号。

图4. Fc Receptor Binding Inhibitor Antibody

(货号：14-9161-73) 封闭效果检测图。

所以，Fc受体封闭能够有效的降低由Fc受体导致的背景信号甚至假阳性信号。

如何进行Fc受体封闭？

究其根本，目前常用的Fc受体封闭方法是在流式抗体染色前，添加封闭试剂来与Fc受体结合进行“占位”，从而使得Fc受体丧失结合流式抗体的能力，常见封闭试剂主要包括血清或者血清中纯化的IgG、抗CD16/32的抗体以及重组表达的Fc。这里列出了Invitrogen eBioscience针对不同种属细胞进行Fc受体封闭的产品。

Question & Answer

问

Fc受体封闭如何操作？

答

具体看封闭剂厂家的建议，如使用我司的产品，在流式抗体染色前进行封闭，具体操作如下。另外，封闭之后一般无需清洗即可进行流式抗体的染色。

小鼠细胞：将细胞用0.5-1 μg纯化的抗小鼠 CD16/CD32/100 μL 2-25°C预孵育10-20分钟。

人细胞：将细胞用20 μL纯化的人Fc受体结合抑制剂/100 μL 2-25°C预孵育10-20分钟。

问

如果我的细胞没有Fc受体表达，是否可以不做Fc受体封闭？

答

是的，如果确认没有Fc受体表达，可以不做。如果不确定细胞上有没有Fc受体表达，建议做Fc受体封闭，以防万一。

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流式细胞术是重要的细胞分析方法学，赛默飞世尔科技的Gibco、Invitrogen和Thermo Scientific产品品牌可提供从流式仪器到抗体和试剂的流式整体解决方案。其中Invitrogen eBioscience陪伴着每一代流式科学家和技术人员获得成果、共同成长，这些年来我们一起见证以Anti-FoxP3为代表的流式抗体深受喜爱、更多种类的流式荧光染料欣然上市以及现在有着更丰富的产品和工具，满足高校研究院、生物技术公司、药企等从早期基础研究到临床转化和生产等不同阶段的需求，加速生命科学行业的进程发展。