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色谱柱粒径越小，分离度一定越好吗？
在液相色谱方法开发过程中，色谱柱对于分离效果的影响是最大的。色谱柱的参数包括：键合相、柱长、直径、粒径、孔径。
做过液相的工程师肯定都深深记牢这句口诀：
● 同等长度的色谱柱，粒径越小，分离效果越好；
● 同等粒径的色谱柱，长度越长，分离效果越好；
● 同等粒径的色谱柱，内径越小，最佳的体积流速越小。
那么，在相同的方法条件下，同等长度的色谱柱，粒径越小，分离效果一定越好吗？小编带您在实操中一探究竟。
（图片来源：baotu）
案例一：儿茶酚胺及代谢物的测试
儿茶酚胺即含有邻苯二酚（即儿茶酚）结构的胺类化合物，包括多巴胺、去甲肾上腺素和肾上腺素及它们的衍生物。
图1 Xtimate® C18（2.1*100mm，1.8μm）
测试儿茶酚胺及代谢物
图2 Xtimate® C18（2.1*100mm，3μm）
测试儿茶酚胺及代谢物
在LC-MS（液相色谱串联质谱）检测时，肾上腺素(E)、去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)、甲氧基肾上腺素(MN)和甲氧基去甲肾上腺素(NMN)这5个物质极性较大。
在月旭Xtimate® C18（2.1*100 mm，1.8μm）规格的色谱柱上保留均较弱（图1）。尽管DA和MN在质谱上可以分离，但DA和MN色谱上未能分离，在临床测试中，我们还是希望代谢物在色谱上也能分离。
在相同的条件下，仅更换使用Xtimate® C18（2.1*100mm，3μm）规格的色谱柱，5个物质保留均增加，在色谱上达到完全分离（图2）。
案例二：某杂质A和杂质B的分离
图3 AQ-C18（4.6*250mm，3μm）
测试杂质A和杂质B
图4 AQ-C18（4.6*250mm，5μm）
测试杂质A和杂质B
从上两图中可以看出，在方法不做大的调整情况下，使用月旭AQ-C18（4.6*250mm，3μm）规格的色谱柱，杂质A和杂质B之间的分离度仅达到1.2（图3）。经过多种方法的优化，杂质A和杂质B的分离度仍徘徊在1.2左右。
更换月旭AQ-C18（4.6*250mm，5μm）规格的色谱柱，仅调整流速，杂质A和杂质B之间的分离度达到1.6（图4），满足分析要求。
原理分析：
Van Deemter方程第一项即为涡流扩散项。色谱柱中充满了固定相填料，而这些填料的存在会阻碍溶质分子运行，填料粒径越大，溶质分子“绕行”距离就越远，即在填料孔径中停留的时间就越长。
在案例一中：儿茶酚胺类物质属于强极性物质，在色谱柱上保留弱。在相同填料、相同内径和长度的色谱柱以及检测条件下，相同流速的流动相对保留在3μm粒径的UHPLC色谱柱上的儿茶酚胺类物质的洗脱能力比1.8μm粒径的UHPLC色谱柱的要弱，所以达到了分离度增加的效果。
在案例二中：色谱柱均为4.6*250mm规格的色谱柱，仅粒径不同。该规格下5μm粒径的色谱柱最佳流速为1mL/min，3μm粒径的色谱柱最佳流速需要达到1.67mL/min，而这个流速下的压力已经超过HPLC的耐压值，故无法采用最佳流速。最终，5μm粒径的色谱柱使用的是最佳流速1mL/min，3μm粒径的色谱柱仅使用0.8mL/min的流速，远低于最佳流速，故分离效果并没有5μm色谱柱好。
经过以上两个案例，对于较难分离的分析物，小伙伴们如果尝试多种方法仍未达到令人满意的分离效果，不妨尝试把色谱填料的粒径改大或改小，都可以试试，可能会有意想不到的效果哦！
作者：韩燕
排版：赵林
审核：邹天骏
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