ASTM F2944-20
自动菌落形成装置（CFU）分析的标准实施规程培养中细胞和菌落计数和表征的图像采集和分析方法

Standard Practice for Automated Colony Forming Unit (CFU) Assays—Image Acquisition and Analysis Method for Enumerating and Characterizing Cells and Colonies in Culture

标准号

ASTM F2944-20

发布

2020年

发布单位

美国材料与试验协会

当前最新

ASTM F2944-20

 

 

引用标准

ASTM F2998 ASTM F3294 ISO 20391-1 ISO 20391-2

适用范围

1.1 本实践描述了一种使用图像分析对源自干细胞或祖细胞群的集落的数量和生物特征进行定量测量的程序。
1.2 这种做法适用于体外实验室环境。
1.3 这种做法利用：(a) 细胞和集落图像捕获的标准化协议，这些细胞和集落源自在定义的视场 (FOV) 中对定义的起始细胞群体进行体外处理，以及 (b) 图像处理和分析的标准化协议。
1.4 相关的 FOV 可以是二维的或三维的，具体取决于所询问的 CFU 测定系统。
1.5 分析结果中使用的主要单位是 FOV 中存在的菌落数量。此外，还可以根据现有的形态特征、分布特性或使用二级标记（例如染色或标记方法）得出的特性来评估 FOV 内各个集落和细胞的特征和子分类。
1.6 成像方法要求以足够的分辨率捕获相关 FOV 的图像，以便能够检测和表征单个细胞，并且 FOV 足以检测、区分和表征集落作为评估的完整对象。
1.7 适用于二维和三维数据集的图像处理程序用于将细胞或集落识别为视场内的离散物体。成像方法可以针对多种细胞类型和细胞特征进行优化，使用用于分割和聚类的分析工具，以指示共享谱系关系（即，克隆扩展）的方式通过接近度或形态来定义彼此相关的细胞组。单个创始干细胞或祖细胞）。
1.8 单个菌落对象的特征（每个菌落的细胞数、细胞密度、细胞大小、细胞分布、细胞异质性、细胞基因型或表型以及次级标记表达的模式、分布和强度）可以提供潜在生物学特性差异的信息的克隆后代。
1.9 在适当控制的实验条件下，集落之间的差异可以提供有关起始群体内集落创建细胞 (CFU) 的生物学特性和潜在异质性的信息。
1.10 细胞和集落面积/体积、数量等可表示为细胞培养面积（平方毫米）或初始细胞悬浮液体积（毫升）的函数。
1.11 使用两种或多种光学方法对 FOV 进行连续成像对于积累有关样本中单个细胞或菌落物体的定量信息可能很有价值。此外，在过程跟踪和验证的设置中，需要对同一样品进行重复成像。因此，这种做法需要一种使用定义的坐标系可重复识别 FOV 区域/体积内细胞和集落（质心）位置的方法。
1.12 为了实现足够大的视场（FOV），可以在高放大倍率下将足够分辨率的图像捕获为多个图像场/图块，然后组合在一起以形成代表整个细胞培养区域的马赛克。
1.13 对组织工程、再生医学和细胞治疗中常用的细胞和组织进行常规测定和分析，以确定原始干细胞和祖细胞群的数量、流行率、生物学特征和生物潜力。
1.13.1 常见适用的细胞类型和细胞来源包括但不限于：哺乳动物干细胞和祖细胞；成人来源的细胞（例如，血液、骨髓、皮肤、脂肪、肌肉、粘膜）细胞、胎儿来源的细胞（对于 1 此做法受 ASTM 医疗和外科材料和设备委员会 F04 的管辖，并且是TEMP 细胞和组织工程构建小组委员会 F04.43 的直接责任。当前版本于 2020 年 4 月 1 日批准。2020 年 6 月发布。最初于 2012 年批准。上一版本于 2012 年批准为 F2944–12。DOI：10.1520/F2944– 20. 版权所有 © ASTM International, 100 Barr Harbor Drive, PO Box C700, West Conshohocken, PA 19428-2959. United States 本国际标准是根据《国际标准制定原则决定》中确立的国际公认的标准化原则制定的。世界贸易组织贸易技术壁垒 (TBT) 委员会发布的标准、指南和建议。例如，脐带血、胎盘/脐带、羊水）；胚胎干细胞（ESC）（即源自囊胚的内细胞团）；诱导多能细胞（iPC）（例如，重编程的成体细胞）；培养扩增细胞；以及特定类型组织的终末分化细胞。
1.13.2 与克隆集落内部和克隆集落间分化检测相关的成熟分化表型的常见应用实例包括：造血表型（红细胞、淋巴细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞等）、成体组织特异性表型祖细胞表型（成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等）和其他组织（肝细胞、神经元、内皮细胞、角质形成细胞、胰岛等）。
1.14 各种组织中干细胞和祖细胞的数量可以通过使用保留干细胞和/或祖细胞群的活力和生物潜力的方法从组织中释放细胞，并将组织来源的细胞置于体外进行测定。细胞在体外环境中，导致干细胞和祖细胞作为克隆集落的有效激活和增殖。因此，可以根据观察到的已形成的集落形成单位（观察到的集落形成单位（oCFU））的数量来估计干细胞和祖细胞的真实数量（真正的集落形成单位（tCFU））（1-3） 2（图A1.1）。干细胞和/或祖细胞的流行率可以根据检测到的观察到的集落形成单位（oCFU）的数量除以所测定的总细胞数来估计。
1.15 细胞和集落计数的自动图像采集和分析方法（本文所述）已经过验证，并发现与当前在明场或明场下手动观察者定义的视觉细胞和集落计数的“黄金标准”相比，可提供卓越的准确度和精密度。带或不带血细胞计数板的荧光显微镜 (4)，减少观察者内部和观察者之间的差异。过去有几个小组尝试自动化此过程和/或类似过程 (5, 6)。最近的报告进一步证明了在细胞甚至核水平上提取各种细胞类型集落的定性和定量数据的能力 (4, 7)。
1.16 软件和硬件的进步现在广泛地实现了系统化的自动化分析方法。这种不断发展的技术需要就本实践中提出的测量单位、术语、过程定义和分析解释达成普遍一致。
1.17 自动化 CFU 分析的标准化方法为提高 CFU 检测在多个科学和商业领域的价值和实用性提供了机会：
1.17.1 自动化 CFU 分析的标准化方法为通过优化通用方案和优化 CFU 分析方法的特异性提供了机会。针对特定细胞类型和 CFU 测定系统的定量指标，可在不同实验室之间统一应用。
1.17.2 自动化 CFU 分析的标准化方法通过提高通量和减少工作流程需求，为降低生物科学各个方面的菌落分析成本提供了机会。
1.17.3 自动 CFU 分析的标准化方法为提高实验系统的灵敏度和特异性提供了机会，这些实验系统旨在检测体外条件、生物刺激、生物材料和体外加工步骤对附着、迁移、增殖、分化和生长的影响。干细胞和祖细胞的存活。
1.18 局限性描述如下：
1.18.1 集落鉴定——细胞来源/集落类型/标记变异性——来自不同组织来源和不同体外环境的干细胞和祖细胞会表现出不同的生物学特征。因此，检测细胞或细胞核和所用二级标记的具体方法以及各自染色方案的实施将根据 CFU 测定系统、细胞类型和所询问的标记而有所不同。用于检测细胞和集落、定义集落对象和表征集落对象的图像捕获和图像分析的优化方案将根据所使用的细胞来源和所使用的 CFU 系统而变化。这些协议需要在每个应用中进行独立的优化、表征和验证。然而，一旦定义完毕，这些就可以在实验室之间以及跨临床和研究领域进行推广。
1.18.2 仪器引起的图像捕获变化——如果处理不当，上述图像采集组件的选择可能会对细胞分割和随后的集落识别产生不利影响。例如，使用水银灯泡而不是光纤荧光光源或光学器件的一般未对准可能会产生不均匀的照明或构成主要大视场图像的平铺图像的渐晕。这可以通过在图块拼接之前对大视场图像中的每个图块应用背景减法例程来校正。
1.18.3 CFU 分析系统相关的成像伪影变异——除了必须利用定义菌落识别的独特特征呈现菌落物体外，来自每个 CFU 系统的每个图像还可能呈现非细胞和非菌落伪影（例如例如，细胞碎片、棉绒、玻璃畸变、反射、自发荧光等），如果不加以识别和管理，可能会混淆细胞和集落的检测。
1.18.4 图像捕获方法和质量控制变化——图像质量的变化将显着影响图像分析方法的精度和再现性。焦点、照明、平铺配准、曝光时间、淬火和发射光谱渗色的变化都是对图像质量和再现性的重要的潜在限制或威胁。 2 括号中的黑体数字指的是本标准末尾的参考文献列表。 F2944 − 20 2 1.19 以 SI 单位表示的值被视为标准值。本标准不包含其他计量单位。
1.20 本标准并不旨在解决与其使用相关的所有安全问题（如果有）。本标准的使用者有责任在使用前建立适当的安全和健康实践并确定监管限制的适用性。
1.21 本国际标准是根据世界贸易组织贸易技术壁垒（TBT）委员会发布的《关于制定国际标准、指南和建议的原则的决定》中确立的国际公认的标准化原则制定的。

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