ASTM E2186-02a(2010)
用彗星分析法测定真核细胞中DNA单线损伤的标准指南

Standard Guide for Determining DNA Single-Strand Damage in Eukaryotic Cells Using the Comet Assay

被代替

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标准号

ASTM E2186-02a(2010)

发布

2002年

发布单位

美国材料与试验协会

替代标准

ASTM E2186-02a(2016)

当前最新

ASTM E2186-02a(2016)

 

 

适用范围

细胞应激的一个常见结果是 DNA 损伤增加。 DNA 损伤可能以碱基改变、加合物形成、链断裂和交联的形式表现出来 (19)。链断裂可以通过多种方式引入，直接由基因毒性化合物、通过诱导细胞凋亡或坏死、其次通过与氧自由基或其他反应性中间体的相互作用、或者作为切除修复酶的结果(20-22)。除了与癌症相关之外，研究还表明，细胞 DNA 损伤的增加先于或对应于成虫、胚胎和幼虫的生长减缓、发育异常以及存活率降低 (16,23,24)。彗星测定可轻松用于收集 DNA 链断裂的数据 (9,25,26)。它是一种简单、快速且灵敏的方法，可以比较不同细胞群中的 DNA 链损伤。如本指南中所述，该测定有助于检测单个细胞中的 DNA 单链断裂和碱性不稳定位点，并可以确定它们相对于对照或参考细胞的丰度 (9,16,26)。该检测具有许多优点；测量单个细胞中 DNA 的损伤，只需采样极少量的细胞即可进行测定（约 10 000 个），该测定几乎可以在任何真核细胞类型上进行，并且已被证明在比较研究中，它是检测 DNA 损伤的一种非常灵敏的方法 (2, 27)。这些是一般准则。该测定有多种程序变体。使用的变化取决于所检查的细胞类型、感兴趣的 DNA 损伤类型以及进行检测的实验室的成像和分析能力。为了使 DNA 可视化，可以用荧光染料对其进行染色，或者为了进行光学显微镜分析，可以对 DNA 进行银染 (28)。本指南仅描述荧光染色方法。 DNA 迁移的显微测定可以使用目镜测微仪通过肉眼进行，也可以使用图像分析软件进行。可以使用校准的目镜测微计或根据迁移程度将细胞分为四到五类来进行肉眼评分 (29, 30)。图像分析系统由连接到荧光显微镜的 CCD 相机以及专门设计用于捕获和分析荧光染色细胞核图像的软件和硬件组成。使用这样的系统，可以测量细胞核内外 DNA 的荧光强度和分布 (8)。使用不同的程序变体，该测定可用于测量特定类型的 DNA 改变和 DNA 修复活性 (1、3、8、10、13、14、17、18)。碱性裂解和电泳条件用于检测单链 DNA 损伤，而中性 pH 条件则有助于检测双链断裂 (31)。可以使用各种样品处理来表达特定类型的 DNA 损伤，或者如在一种方法中那样，保留 DNA 修复位点的链损伤 (10)。核酸酶消化步骤可用于在特定病变位点引入链断裂。使用这种方法，可以通过使用核酸内切酶 III (18) 检测氧化碱基损伤，也可以通过使用 T4 核酸内切酶 V (3) 检测由于暴露于紫外线 (UV) 导致的 DNA 修饰。这种类型的修改极大地扩展了该测定的实用性，并且是其多功能性的好例子。对细胞生物学有足够的了解......

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