用MS鉴定蛋白质的多数方法中，或经过1D或2D胶分离或不经分离直接鉴定，首先都需要蛋白水解酶的酶解，最常用的酶是胰蛋白酶，它是一种序列特异性的蛋白酶，只切割精氨酸或赖氨酸残基的C端。从胶上切下用于酶解的体积尽可能小的胶带，随后再将胶切成约1mm3的小块放于小离心管中。下面的步骤是根据Wilm等人发表的方法而来的。用100mM碳酸氢氨(一个2D胶斑点~50ul)洗胶块5min，之后除去缓冲溶液，加50ul乙腈并使胶脱水10-15min。如果胶块没有完全脱水就需要再换一次乙腈，最后倾出乙腈，在Speed-Vac
中完全干燥(在低温状态~15min),用50ul含有10mMDTT的100mM碳酸氢氨溶液(新鲜配置)再水化胶,在56℃下加热30min还原样品，之后倾出DTT溶液，加乙腈于胶中15min后在Speed
–Vac 中干燥(低温
15min)，加50ul含有55mM碘乙酰胺的100mM碳酸氢氨溶液烷基化半胱氨酸残基，避光在室温下放置20min，弃去上清液用100mM的碳酸氢胺缓冲液冲洗，然后换用新的碳酸氢胺缓冲液洗15min,如果这一步还不能完全脱色，需用100mM碳酸氢氨：乙腈1:1的溶液在37℃振摇
30min，重复此步骤直到完全脱色。倾出液体加入50ul的乙腈约15min后，在Speed-ac
中干燥,再在50mM包含测序级胰酶的碳酸氢氨溶液中再水化。酶的储存液是在25ug的胰酶中加250ul的0.1%三氟乙酸。每份(15ul)被储存在
4℃下。活性酶溶液的制备是每份15ul加100ul的50mM碳酸氢胺溶液,终浓度是13ng/ul.。加入约20ul的胰酶溶液于胶块中(充分再水化后的胶块)并放置在4℃下再水化45-60min，移走过量的胰酶溶液加入少量的
50mM的碳酸氢胺溶液(10-20ul)使胶块在酶解过程中保持浸润，在37℃孵育1小时，然后在室温下过夜。
下一步样品处理是根据不同质谱鉴定方法来决定，主要有三种鉴定技术按照被鉴定蛋白难易度而依次应用.
MALDI-TOF是一种最有效的鉴定技术,它可通过肽指纹图谱(PMF)来鉴定蛋白质。用这种技术检测胰酶酶切后的肽质量数有很高的准确度(达到
100ppM或更高),可与理论上预测的胰酶对蛋白酶切后所形成的一系列肽质量数比较(数据库查询)。由于大多数肽段只带一个电荷，在谱中以单峰的形式存在，因此MALDI-TOF
MS数据很容易解释。对于基因组序列已完全确定了的生物体如Saccharomyces cerevisiae 和Caenorhabditis
elegans，这种技术尤其有用，因为所有被胰酶酶切后生成的多肽质量数可以用一个封闭的数据包准确预测。MALDI-TOF(带反射功能)能够通过源后延迟PSD功能获得肽序列信息，然而这种技术要求样品的初始量至少达pmol，且质谱图不如传统的MS/MS
好解释。MALDI-TOF，与其它下面将讨论的技术不同，分析蛋白混合物和确定混合物中所有单个组分的能力较差。尽管如此，但是通过反复搜寻仍经常可从
MALDI-TOF数据中鉴定出2~3个蛋白质。作为应用MALDI-TOF的一个例子，在下面介绍用该方法鉴定酵母中p24蛋白。分析蛋白酶解物，是根据Jensen
等(14)改良的方法。在该方法中，先将5%甲酸点到预先涂好基质的不锈钢靶上，然后将与甲酸等体积的酶解上清液直接加样于靶上进行测定。该方法用于微量多肽更为灵敏，但不适合源后裂解，因为靶的表面样品含量很快就会削减.
新鲜配制10mg/ml的a -氰基-4-羟基肉桂酸于丙酮/2-丙醇(1:1v/v)中，以
4:1的比例和硝酸纤维素[10mg/ml在丙酮/2-丙醇(1:1v/v)]混合。点约0.3m l
基质混合液于靶上，需将基质经蒸发保持成薄层(膜)。很小心地加0.3m l 5%甲酸于靶上，然后再直接加0.5m l样品。让靶自然干燥。用5%甲酸洗靶(~1m
l/靶)。用高压气体吹干过量的洗液，最后将靶装入质谱仪。
如得不到完整的序列信息，或当MALDI-TOF
分析不能确定时，需要采用电喷雾电离串联质谱(ESI-MS/MS)来获得确定的序列信息以用于数据库的检索，或用于克隆实验。当应用MS/MS分析时，首先选择要测序的肽离子再由碰撞诱导解离(CID)得到其碎片离子，由CID得到的肽的碎片离子可以从图1得到很好的说明。如果采用ESI-MS时，胰酶酶解的肽通常得到的是双电荷分子离子，这是因为分子的每一个末端都是最可能的质子化位点，任何骨架键的断裂均可产生两个单电荷序列离子碎片，由骨架键断裂产生的离子如果电荷在N末端,碎片被定义为a，b，c，如果电荷在C-末端被定义为x，y，z,
通常在低能量裂解情况下，不产生c和z离子，a离子是b离子失去CO(28Da)得到的。骨架键断裂还可能得到immonium离子和acylium离子。Acylium离子是由两个骨架键断裂后形成的。离子m/z值高于母离子的通常为y离子系列，在许多情况下,
从y离子系列可以得到部分序列信息，这些信息是数据库检索的基础。
纳升电喷雾(纳升流速的ESI)是基于Wilm和
Mann的理论研究，现在已经发展成为分析从1D和2D上分离得到的微量蛋白质的有利工具。蛋白质在胶上酶解后得到的酶切肽段样品1ul，经被拉伸成超微孔点的玻璃或石英针孔喷雾而出，一微升可以喷1小时或更长的时间，这样，在温和能量碰撞下可重复进行许多次MS/MS实验。与快速数据库检索相联，可进行实时蛋白质鉴定。在同次喷雾中，还可进行进一步的确认实验，或对复杂混合物组分深入研究，另外，通常在三级四级杆质谱仪器中，这种方法可以通过母离子扫描来分析翻译后修饰如糖基化。最初磷酸肽和糖肽是基于从CID得到的特殊信号离子来鉴定的。所有的肽离子都有序地进入碰撞室，但是质谱所记录的是那些产生感兴趣的信号离子的母离子。举个例子，选择作为子离子(PO3-)的m/z79作为磷酸肽的指示物，它们的母离子被裂解以确定磷酸化位点。纳米串联质谱是相当灵敏并在鉴定生物学重要复合物时发挥着关键的作用。纳米喷雾接口可用在许多商业电喷雾质谱仪中。专用细针可通过已商业化设备(puller)牵拉而成
(Sutter Instruments Novato,CA,USA)或购自现成产品(Protana A/S; New Objective
Inc.,Cambridge,MA;Micromass,Manchester,UK)。
样品上样进行质谱分析的另一个方法是用在线LC-MS/MS，即在电喷雾接口前采用HPLC分离多肽。当多肽从色谱柱中流出时,质谱(Q-
TOF,Micromass,Manchester,UK)自动选择母离子进行MS/MS分析。为了保证灵敏度,75到180um大小的柱子采用低流速。这个系统比大孔径柱难于维护,但是一旦得到一个稳定的配置，他们将显示非常强大的功能.
在线方法有几个优点,
包括高灵敏度、在线脱盐和自动化等。当然每运行一次产生的几百个MS/MS图谱是相当大的文件(超过1Gb)，但是相应软件的出现使得预先不需对数据做任何说明就可以对完整的运行过程进行自动分析,
而且数据库检索的速度已不成问题，能够在几分钟内就得出所有检索的结果.
纳米电喷雾和在线LC-MS/MS两种方法是相互补充的，各有优势。例如，纳米电喷雾更适于全新序列的分析(de novo
sequencing)，可以对非常复杂的混合物进行蛋白序列分析，而在线LC-MS/MS几乎可以达到无人操作的自动化程度(unattended
operation)。许多测序实验室同时使用这两种方法。在下面我们将介绍因样品不同而采用不同技术的策略.
