TIM-3与肿瘤免疫的关系及TIM-3抗体的体外生物学研究

研究表明，TIM-3在一些自身免疫性疾病和肿瘤的发生发展中发挥着重要的作用，在肿瘤微环境中TIM-3的过度活化是肿瘤免疫逃逸的一个重要因素，TIM-3的高表达往往提示着预后不良。体外生物学研究表明TIM-3抗体的体外免疫增强功能与是否竞争特定TIM-3配体结合不存在相关性。TIM-3的存在不利于机体的抗肿瘤免疫，阻断TIM-3信号或联合处理其他协同共刺激信号，可以有效抑制肿瘤的生长。

1、TIM-3与肿瘤免疫的关系

TIM-3（T cell immunoglobulin domain and mucin domain-3）是一种T细胞表面抑制性分子，能够引起癌症与慢性病毒感染过程中T细胞的衰竭，如体外生物学研究表明TIM-3在骨肉瘤中具有促癌作用。在其他研究中发现，适应性耐药性会造成免疫检查点TIM-3上调，有研究者利用2个临床恶性肺癌基因突变模型，EGFR和KRAS基因，以完全免疫感受态小鼠为模型，进行了一系列的实验。在PD-1阻断抗体治疗前、中、后分析肿瘤免疫微环境。几个免疫检查点的表达--最明显的，TIM-3在用抗PD-1治疗产生耐药性的动物的T细胞中高表达。在独立实验中，当抗TIM-3抗体与抗PD-1药物联用时可抑制抗PD-1治疗耐药性的产生。

研究者利用乳腺癌样本和小鼠模型进行试验，结果发现在乳腺肿瘤的树突状细胞上发现了TIM-3。正是考虑到TIM-3在免疫系统中的重要作用，科学家们就推测靶向树突状细胞上的TIM-3可能会激活T细胞。而在随后研究中，用靶向TIM-3的抗体药物和化疗药物紫杉醇治疗小鼠后，肿瘤细胞明显减少。研究发现TIM-3抗体会导致树突状细胞产生化学信使，进而激活T细胞，引起抗肿瘤免疫反应。因此在实体瘤治疗过程中，联合抑制TIM-3和PD-1的效果优于单独抑制。

2、TIM-3抗体的体外生物学研究

体外生物学研究一般指的是在各种动物的体外器官、组织和细胞以及分子水平上进行的研究。上海美迪西的生物部在体外生物学领域有丰富广泛的经验，通过酶水平测定、细胞水平测定、细胞生物学、生物化学、体外同位素测定、稳定细胞株建立、基因敲除、RNAi和MicroRNA技术等，提供一套完整的生物学服务。

采用细胞转染技术获得表达人TIM-3分子的细胞系L929-human TIM-3，间接免疫荧光染色及流式细胞术检测抗人TIM-3 mAb 4E8及9H7与人TIM-3分子结合的能力；同时ELISA检测4E8阻断人TIM-3融合蛋白(TIM-3 Ig-hu Fc)与半乳糖凝集素-9(galectin-9，Gal-9)结合的能力；流式细胞术检测4E8或9H7阻断TIM-3 Ig-huFc与293T-CEACAM-1瞬时表达细胞表面癌胚抗原相关黏附分子1(CEACAM-1)结合的能力及4E8或9H7阻断TIM-3 Ig-huFc与凋亡细胞表面TIM-3配体磷脂酰丝氨酸(PtdSer)结合的能力；混合淋巴细胞反应(MLR)及ELISA检测TIM-3 m Ab 4E8及9H7对CD4~+T细胞分泌白介素-2(IL-2)及干扰素-γ(IFN-γ)的影响。

结果通过对稳定表达人TIM-3分子的细胞L929-human TIM-3的间接免疫荧光染色，验证了4E8及9H7均可与人TIM-3分子特异性结合。

（1）Gal-9与TIM-3结合实验结果显示，4E8可阻断TIM-3与Gal-9的结合。但CEACAM-1或Ptd Ser与TIM-3结合实验结果显示，4E8不可阻断TIM-3与CEACAM-1或PtdSer的结合，而9H7既可阻断TIM-3与CEACAM-1的结合又可阻断TIM-3与PtdSer的结合。

（2）MLR实验结果显示，4E8及9H7均可增强CD4~+T细胞分泌IL-2的能力，且与PD-1抗体nivolumab有协同作用，差异有统计学意义(P<0.05)。

（3）4E8及9H7均可增强CD4~+T细胞分泌IFN-γ的能力，且4E8与PD-1抗体nivolumab具有显著的协同效果，差异有统计学意义(P<0.05)。

因此该项研究发现：

（1）TIM-3 mAb 4E8可阻断TIM-3与Gal-9的结合，不可阻断TIM-3与CEACAM-1或PtdSer结合。此外，4E8具有增强CD4~+T细胞分泌IL-2及IFN-γ的能力且与PD-1 mAb具有协同效果，但4E8对CD4~+T细胞的作用不依赖于阻断TIM-3与其配体CEACAM-1或PtdSer的结合。

（2）TIM-3 mAb 9H7可阻断TIM-3与CEACAM-1及PtdSer的结合，具有增强CD4~+T细胞分泌IL-2作用且与PD-1 mAb具有协同效果。同时也可增强CD4~+T细胞分泌IFN-γ的能力。

以上数据表明，TIM-3抗体的体外免疫增强功能与是否竞争特定TIM3配体结合不存在相关性。

由于TIM-3表达对机体肿瘤免疫反应极度不利，因此TIM-3可能是肿瘤免疫治疗的新靶点，联合使用TIM-3和抗PD-1抗体治疗能取得较好的疗效，是一种很有前途的免疫疗法。而体外生物学研究表明TIM-3抗体的体外免疫增强功能与是否竞争特定TIM3配体结合不存在相关性。