小分子干扰RNA是一种短片段双链RNA分子,能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA,可以抑制特定的哺乳动物基因表达。制备小分子干扰RNA的方法可以通过体外制备siRNAs,然后经过转染或者电转导人哺乳动物细胞,或者是依赖能够表达siRNA的DNA载体或者表达框转移到细胞中。一些公司提供的细胞转染技术服务包括载体构建或转染,如常见的siRNA表达载体的转染。
小分子RNA干扰药物发挥的是基因沉默剂的作用,期望通过药物来沉默那些可能导致疾病的基因表达。因此在治疗疾病的过程中,只要知道了某种疾病的致病基因,就可以设计出针对该基因mRNA的小分子干扰RNA,抑制或封闭该致病基因的表达。siRNA能够在哺乳动物中抑制特定基因的表达,而且抑制基因表达的时间可以控制在发育的任何阶段,产生类似的基因敲除的效应。基因敲除是通过一定的途径使机体特定的基因失活或者缺失的技术,基因敲除价格根据敲除的方法不同而不同。
与传统的基因敲除技术相比,这一技术具有投入少,周期短,操作简单等优势。因而,近年来,越来越多的实验室开始使用siRNA研究基因的功能。然而siRNA导入细胞的效率较低,现阶段最为常用的载体有病毒载体、脂质体,其他载体介导的如磷酸钙共沉淀等,目前应用最为广泛的是脂质体,其他的转染方法还需要更进一步的研究。美迪西提供细胞转染技术服务,其生物部在分子生物学、细胞生物学、体外生物学和结构生物学领域有丰富广泛的经验。从最初的cDNA文库构建到药物设计,通过蛋白质纯化,结构测定和分析测定,提供一套完整的生物学服务。
1、小分子干扰RNA技术抑制人卵巢癌基因的研究
(1)siRNA技术可沉默人卵巢癌耐药细胞株PKC-α基因
有研究者采用小分子干扰RNA(siRNA)沉默PKC-α基因,探讨PKC-α基因沉默后人卵巢癌细胞中MDR1的表达及其化疗耐药是否发生逆转,为临床肿瘤耐药的逆转提供新的思路[1]。研究者设计合成针对PKC-α基因的特异性寡核苷酸链,荧光显微镜下比较3种转染试剂的转染效率,选择转染效率较高的试剂进行实验。实验分为:空白对照组(敏感细胞空白对照组及耐药细胞空白对照组)、耐药细胞转染组及耐药细胞空质粒阴性对照。逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及western印迹分析检测siRNA干扰前后人卵巢癌敏感细胞株与耐药株中MDR1及PKC-α基因及蛋白的表达差异;MTT法检测siRNA干扰前后人卵巢癌耐药细胞对顺铂或紫杉醇敏感性的变化。
结果发现利用siRNA干扰PKC-α基因不仅可以抑制人卵巢癌耐药细胞株PKC-α基因,而且可以抑制MDR1基因和蛋白表达,从而部分逆转肿瘤耐药。基于siRNA沉默PKC-α基因的治疗技术可能为临床肿瘤耐药研究提供新的思路,PKC-α和MDR1之间的关系有待进一步研究。
(2)siRNA靶向沉默CXCR4可抑制人卵巢癌细胞增殖
探讨小分子干扰RNA(siRNA)靶向沉默趋化因子受体4(CXCR4)基因对卵巢癌SW626细胞增殖、迁移及侵袭的影响,为卵巢癌的基因治疗提供新的理论依据[2]。方法是构建CXCR4干扰RNA质粒载体,重组扩增后转染CXCR4阳性的人卵巢癌细胞株SW626,以RT-PCR和western印迹分析检测CXCR4基因及蛋白表达的变化,MTT检测CXCR4干扰质粒对卵巢癌细胞增殖的影响,Transwell检测CXCR4干扰质粒对卵巢癌细胞迁移、侵袭能力的影响。
结果转染48h后,人卵巢癌细胞株SW626的转染效率为80%~90%,抑制了卵巢癌细胞CXCR4基因及蛋白的表达(P<0.05),部分抑制了癌细胞的增殖(P<0.01),但此作用并不随时间变化而有明显变化;癌细胞的迁移及侵袭率均明显下降,差异有显著统计学意义(P<0.01)。因此CXCR4siRNA可通过下调CXCR4的表达抑制人卵巢癌细胞的增殖、迁移及侵袭。
小分子干扰RNA技术由于其强大的基因表达调控作用,在各种疾病治疗研究方面具有潜在的应用价值。在对卵巢癌耐药性逆转基因的研究中,除了PKC-α基因、CXCR4基因外,还有RRM2、XIAP等基因。利用siRNA技术干扰与卵巢癌细胞增殖有关的基因的表达,有可能成为卵巢癌细胞耐药性逆转的有效方法。虽然siRNA研究较多,但是至今尚未有siRNA药物开发成功上市,究其研究可能是siRNA存在一些局限性。
2、小分子干扰RNA(siRNA)的局限性
(1)机体损伤
合成的siRNA在哺乳动物体内能够激活天然免疫系统,通过刺激细胞质的模式识别受体,如双链RNA依赖的蛋白激酶(PKR)、视黄酸诱导的基因Ⅰ(RIG-Ⅰ)和TOLL样受体(TLR)等,导致炎症细胞因子的激活及干扰素反应,造成机体损伤。
(2)RNA脱靶效应
siRNA也可以引起一些非靶基因的特异性沉默或表达上调,引起细胞的凋亡或生长抑制。
目前考虑可能是外源性siRNA诱发干扰素通路引起,或非靶基因具有的部分互补序列介导的mRNA降解。
(3)siRNA的毒性
siRNA具有高效性,较低浓度的siRNA就能抑制靶基因的表达,而且siRNA的干扰效应会随着其浓度的增加而增强。但是过量的siRNA不仅会导致与非靶的mRNA不完全互补配对的概率增加,同时可以诱发更强烈的免疫反应,成为siRNA的毒性。而且siRNA导入细胞的效率较低,更多的转染方法还需要进一步的研究。
siRNA这种分子干预方式可以应用与体内外基因的选择性表达,以及肿瘤的治疗,在抗肿瘤药物研发方面提供了新的思路,可缩短药效测试时间,并为多重耐药患者带来了希望。在siRNA基因的研究中,解决siRNA的脱靶效应、毒性及机体损伤的缺陷,将会进一步扩大其应用前景。
[1]小分子干扰RNA(siRNA)抑制PKC-α表达对卵巢癌耐药的影响[J].
[2]siRNA靶向沉默CXCR4基因对人卵巢癌SW626细胞增殖、迁移及侵袭的影响[J].