应用亲和磷酸蛋白质组学筛选氧化应激重塑型LPS通路的侯选信号分子

[摘　要] 　目的: 研究低剂量LPS刺激的Thp - 1细胞在有或无H2O2 预处理时磷酸化蛋白组的差异,以初步筛选氧化应激重塑型LPS通路中的新信号分子。方法: 使用PMA刺激Thp - 1单核细胞36 h使之分化成为成熟的巨噬细胞,静息36 h后,先以等体积的培养基或100μmol/L H2O2 刺激1 h,再以培养基或10μg/L LPS刺激30 min。采用PMAC ( phosphop rotein metal affinity column)富集各组细胞的磷酸化蛋白质,经超滤除盐后进行二维凝胶电泳,比较LPS组和H2O2 +LPS组的磷酸化蛋白图谱的差异,并挑选部分斑点进行质谱鉴定。结果: 相对于LPS组(仅用LPS刺激的细胞) ,在H2O2 +LPS组(LPS刺激前经H2O2 提前处理的细胞)中,有29个磷酸化蛋白斑点在双向电泳图谱中表现出可重复的差异,其中, 17个斑点发生了上调(包括新出现的斑点) , 12个发生了下调(包括消失的斑点) 。我们已经鉴定出其中5个差异蛋白,这些蛋白参与多种多样的细胞过程例如蛋白质降解、信号转导和蛋白质折叠等。其中,在H2O2 +LPS组中显著下调的p roteasome beta - 4亚基与LPS信号传递关系密切。结论: 亲和磷酸蛋白组学有效减少了高丰度的结构蛋白的干扰并增加了信号分子检出的可能性。上述5个蛋白尤其是p roteasome beta - 4亚基可能是氧化应激重塑型LPS通路的重要调节分子。