用1.8 μm反相(RP)色谱柱进行快速氨基酸分析(AAA)

引言

　　氨基酸的检测和定量分析一直是蛋白质和食品分析的重要部分，1951 年Moore 和Stein 研制出了第一台氨基酸分析仪，将未衍生的氨基酸(AAs)用离子交换色谱分离后，用茚三酮进行柱后衍生，在可见区检测[5]。1958 年由Beckman 开发并推出了全自动分析仪。它成为蛋白质分析的里程碑，并在1972 年诺贝尔化学奖核糖核酸酶的研究中发挥了重要作用。以前需要几周完成的分析，用该方法不到1 天就可以完成。Beckman新一代的氨基酸分析仪已将分析时间缩短到大约110 分钟，但用茚三酮灵敏度仍然有问题。

　　用邻苯二甲醛(OPA)和巯基乙醇进行柱后衍生反应有一些可能，但却只能检测一级氨基酸（见图1a）。1971 年首次报道了用OPA对氨基酸进行柱前衍生[6]。衍生物相当不稳定，但这一过程可以实现自动化。灵敏度得到了提高，特别是使用荧光检测(FLD)时。OPA不发荧光，其衍生物有很强的荧光，但二级氨基酸仍不能检测。另一种衍生化试剂氯甲酸9-芴基甲酯(FMOC)和一级、二级氨基酸都能反应生成稳定的衍生物，但其本身却具有很强的UV 吸收和荧光（见图1b）[7]。衍生反应结束后还需要进行提取或与疏水性很强的胺进行反应，以除去过量的FMOC和反应副产物[8]。这种方法也可以作为自动化柱前衍生方[9]，但商品化时存在问题，与没有使用反提取的系统相比，相对标准偏差(RSD)较高。

　　1986 年惠普/安捷伦将这两种化学反应依次结合，不用反提取实现了蛋白质水解液氨基酸的全自动衍生、色谱分离、检测和报告[1]。1988 年开发并销售了商品化的分析仪，总分析时间只有36 分钟，灵敏度达到飞摩尔水平。这对于生物技术公司和大学的研究人员来说，无疑是迈向正确方向的一步，因为他们的样品非常有限，尤其是在药物研发的早期阶段。

　　为了使其在商业上可行，需要进行一些化学上的改进：将硫醇换成3-巯基丙酸(MPA)使OPA衍生物更稳定；所有一级氨基酸先与OPA反应，将一级氨基酸从下一步的反应中定量除去；然后加入FMOC，FMOC只与二级氨基酸反应。由于FMOC、FMOC衍生物和反应
副产物比任何OPA衍生物的疏水性都强，所以它们不会干扰任何一级氨基酸的检测。因为只有几种FMOC衍生物，所以可以使用简单的两段梯度将这些氨基酸与反应副产物和FMOC分离[1]。详见图1 和图2。相应于各个色谱峰的化合物名称见表1。

实验部分

仪器

　　本文中的结果都是在Agilent 1200SL HPLC 系统上测定得到的，该系统包含以下组件：
　　G1312B，SL 型二元泵
　　G1379B，微量脱气机
　　G1367C，高性能多孔板自动进样器(WPS)，配置
　　54 x 2 mL（前面）和15 x 6 mL 样品盘（后面）
　　G1316B，SL 型柱温箱(TCC)，安装低扩散组件
　　G1315C，SL 型二极管阵列检测器(DAD)，配置半微量流通池
　　G1321A，荧光检测器(FLD)

　　仪器上的所有管线内径均为0.12 mm（0.005 英寸）。

　　虽然还没有试验过，但较旧的仪器，如1100 二元泵系统，以及1100 和1200 四元泵系统也可以在4.6 mm内径柱上完成这些分析。建议没有经过广泛试验不要在这些系统上使用3.0 mm 和2.1 mm 内径的柱子，因为使用这些系统延迟体积较大；由于延迟体积效应可能使较早洗脱的峰出现异常。

仪器配置

　　泵参数：混合器和脉冲阻尼器用100 mm 长的管线(0.12 mm 内径)旁路连接，程序设置通过旁路（进样命令0.1 分钟后；见下面的WPS 参数），压缩性设置采用：A = 35，B = 80

　　流速：2.1 mm 内径柱采用0.42 mL/min ； 3.0 mm 内径为0.85 mL/min ； 4.6 mm 内径为2.00 mL/min

　　

　　DAD：PW 0.01 分钟；狭缝4 nM ；停止时间7 min（根据应用调整）；流通池体积= 5 μl，6 mm 光程（安捷伦部件号G1315-60025）
　　信号A：338，10 nm ；参比390，20 nm
　　信号B：262，16 nm ；参比324，8 nm
　　信号C：338，10 nm ；参比390，20 nm
　　信号D：230，16 nm ；参比360，100 nmM

　　信号时间表C)：0.00 分钟338，10 nm ；参比390，20 nm ； 5.53 min 262，16 nm ；参比324，8 nm（根据需要调整； 3.0 mm 内径柱大约5.45 分钟时切
换，4.6 mm 内径柱大约5.4 分钟切换）

　　FLD：PW 0.01 分钟；停止时间7 分钟（根据需要调整），流通池易碎，千万不要将这种检测器串联在其它检测器之前Ex 230 nm；Em 450 nm；滤光片295 nm（默认滤光片）信号时间表：0.00 分钟Ex 230 nm，Em 450 nm，PMT Gain 9（根据需要）5.53 分钟Ex266 nm，Em 305 nm ； PMT Gain 9（根据需要，波长切换时间见DAD，约增加0.03 分钟）

　　TCC：使用时安装低扩散组件；柱子一侧T = 40 °C，出口侧30 °C。两侧都使用低扩散组件。

　　WPS：默认体积设置为0.5 μl，进样器程序中均采用默认进样速度200 μl/min
　　进样器程序
　　1) 从硼酸盐瓶（安捷伦部件号5061-3339）中吸取2.5μl
　　2) 从样品瓶中吸取0.5 μl
　　3) 在清洗口5X混合3 μl
　　4) 等待0.2 分钟
　　5) 从OPA瓶（安捷伦部件号5061-3335）中吸取0.5 μl
　　6) 在清洗口6X混合3.5 μl
　　7) 从FMOC瓶（安捷伦部件号5061-3337）中吸取0.4 μl
　　8) 在清洗口10X 混合3.9 μl
　　9) 从进样稀释液瓶中吸取32 μl
　　10) 在清洗口8X混合20 μl
　　11) 进样
　　12) 等待0.10 分钟
　　13) 不通过阀

用于绘制校正曲线的氨基酸混合液

　　为了建立校正表和校正曲线，将17 种氨基酸加上4 种扩展氨基酸组合在一起，配制成各种浓度氨基酸的混合物溶液，内标的量一定。内标(IS)（正缬氨酸和肌氨酸）是氨基酸辅助试剂盒（部件号5062-2478）的一部分。这个试剂盒里的其它氨基酸（谷氨酰胺[GLN]、天门冬酰胺[ASN]、色氨酸[TRP]和羟脯氨酸[HYP]）组成了扩展氨基酸(EAA)。参见表2 和表3，分别配制成相应的低和高灵敏度溶液。

　　氨基酸标准溶液（10 pMoles/μL 到1 nMoles/μL）：
　　将各1-mL 安瓿的标样（部件号从5061-3330 到5061-3334）分成每份100-μL，置锥形内插管中，加盖，4 °C冷藏保存。根据实验需要，校正曲线可以用2 到5 种标准品制成。

　　扩展氨基酸(EAA)储备液：
　　该溶液是用氨基酸辅助试剂盒（部件号5062-2478）中6 种氨基酸中的4 种配制的。最终浓度为含18 nMoles/μL 谷氨酰胺、天门冬酰胺、色氨酸和4 －羟基脯氨酸的25 mL 去离子水溶液，用做低灵敏度标准溶液（表2）。超声振荡使其溶解。4 °C 下保存。将5 mL，18 nMoles/μL 标样用45 mL 去离子水稀释，配成1.8 nMoles/μL 的溶液，用做高灵敏度标准溶液（表3）。

　　内标储备液：该溶液是用氨基酸辅助试剂盒（部件号5062-2478）中6 种氨基酸中的2 种配制的。最终浓度为含10 nMoles/μL正缬氨酸和肌氨酸的25-mL 去离子水溶液，用做低灵敏度内标（表2）。超声振荡使其溶解，在冰箱中保存(4 °C)。将5 mL. 10 nMoles/μL标准溶液用45 mL 去离子水稀释，配成1 nMoles/μL溶液，用做高灵敏度标准（表3）内标，4 °C 下保存。

HPLC 柱

　　ZORBAX快速分离高通量Eclipse Plus C18，
　　2.1 x 50 mm，1.8 μm，部件号959741-902
　　ZORBAX快速分离高通量Eclipse Plus C18，
　　3.0 x 50 mm，1.8 μm，部件号959941-302
　　ZORBAX快速分离高通量Eclipse Plus C18，
　　4.6 x 50 mm，1.8 μm，部件号959941-902

流动相和进样稀释液

　　流动相A：10 mM Na₂HPO₄: 10 mM Na₂B4O₇，pH 8.2:0.5 mM NaN₃（5.6 克无水Na₂HPO₄ +15.2 克Na₂B4O₇ ?10H₂O溶于4 L 水+ 32 mgNaN₃）。用6 mL 浓盐酸将pH粗调至9 左右，然后进一步调至pH 8.2。使用强酸时需小心。用0.45 μm再生纤维素膜过滤（安捷伦部件号3150-0576）。在室温下约1.5 周内稳定。

　　流动相B：乙腈：甲醇：水（45:45:10，体积比）。所有流动相溶剂必须为HPLC级。

　　进样稀释液：100 ml 流动相A + 1，500 μL 浓H₃PO₄置于100-mL 瓶中。4 °C 保存。用前分装至6-mL 样品瓶中。使用强酸时需小心。

　　氨基酸分析所用的所有消耗品名称和部件号见订购信息。

衍生化试剂

　　硼酸盐缓冲液：安捷伦部件号5061-3339
　　0.4 N 水溶液，pH 10.2。4 °C 保存。必要时可分装。

　　FMOC试剂：安捷伦部件号5061-3337
　　从1-mL FMOC 试剂中吸取每份200-μL，置锥形内插管中，立刻加盖，冷藏(4 °C)；分装后如保存在4 °C，最多7到10 天内可用；如在室温下保存，1天内可用。

　　OPA试剂：安捷伦部件号5061-3335
　从1-mL OPA试剂中吸取每份200-μL，置锥形内插管中，立刻加盖，冷藏(4 °C)；分装后如保存在4 °C，最多7 到10 天内可用；如在室温下保存，1 天内可用。

　　水：去离子水，HPLC级。

　　氨基酸分析所用的所有消耗品名称和部件号见订购信息。

样品制备

　　本文所分析的各种瓶装啤酒样品从当地获得。制备时只需简单的超声脱气。由于碳酸饮料超声时可能引起瞬间爆炸，操作时必须小心。建议将啤酒倒入比其体积大得多的广口烧杯中，以便容纳产生的大量泡沫。

结果与讨论

分离条件的选择

　　在本应用中，我们采用了新的方法，使氨基酸分析可以在范围更广泛的色谱柱上进行。我们报告的结果是在快速分离高通量Eclipse Plus C18 柱上得到的，这些4.6-、3.0-和2.1-mm 内径柱的填料粒径都是1.8-μm，柱长都是50-mm。每个方法的唯一区别是流速，从而可以保持相同的线速度、检测器波长切换时间，这样，二级氨基酸可以包含在同一个的色谱图中。

　　我们也用快速分离高通量Eclipse Plus C8 柱和快速分离高通量Eclipse XDB-C18 柱与C8 柱上进行了分离，这些柱子都填充了1.8-μm填料，规格也相同（本文未给出数据）。所有柱子都得到了与快速分离高通量Eclipse Plus C18 柱非常相似的结果（本文未给出数据）。在不同尺寸快速分离高通量Eclipse Plus C18柱上得到的相应的分离结果见图3和图4，分别为DAD和FLD 检测。可以看出，不管用哪种规格的色谱柱，所有色谱图的保留时间只有微小的变化。这些变化是由三种不同尺寸柱子延迟时间的微小差异造成的。因为延迟体积是恒定的，所以流速越高延迟时间越短。

重复性和线性

　　在以前的这类分析中，二级氨基酸的重复性总是比一级氨基酸差[1-4]。本文报道的方法中，我们提高了二级氨基酸的重复性，使其与一级氨基酸相当。在ZORBAX Eclipse Plus-C18，2.1-mm 内径柱上分析所得到的相关数据见表4 和表5（不带内标），4.6-mm内径柱见表6（带内标）。表4 中的绝对峰面积重复性好，所有氨基酸的平均RSD低于2%，只有2 个在3%以上。请注意，表5 和表6 中显示所有氨基酸的线性也非常好，所有氨基酸R2 都接近1.00，加内标的要更好一些。用Eclipse Plus-C18，3.0-mm 内径柱不加内标的分析结果见图5 和图6。图7 可见在EclipsePlus-C18，2.1 内径柱上进行低浓度氨基酸分析（柱上5.0 pMoles）的色谱重复性。上下重叠的图谱可以很容易地比较保留时间的重复性和色谱峰大小。这些是原始数据，没有校正，也没加内标。

扩展氨基酸(EAA)和内标(IS)

　　有几种氨基酸在蛋白质酸水解过程中会被破坏（天门冬酰胺、谷氨酰胺和色氨酸），还有一种氨基酸除了结构蛋白（羟脯氨酸）外，在其它地方几乎不存在。此外，许多分析人员愿意在样品中使用内标，以改善准确度和重复性。为了得到最好的结果，需要谨慎选择内标。通常在下列两种样品处理步骤中加入内标：

　　1. 在进行任何样品处理之前加到样品中（如，酸水解之前）。它将较正可能发生的所有改变，当然，内标应对水解稳定，并与样品中的其它组分进行相同的衍生化反应。为了正确地使用这种方法，标准品也应该水解；但这通常会带来更多的变数，因为各种氨基酸的稳定性不同。丝氨酸就是一个例子，它随着水解时间的延长逐渐被破坏。因此使用内标非常有用。

　　2. 仅在分析前加入，将较正体积量取误差和自动进样器的偏差，同样假设内标和样品组分具有同样的反应性。本应用中采用的是这种方法。

　　这里报道的OPA/FMOC分析中，可以使用两种内标：一级氨基酸用正缬氨酸，二级氨基酸用肌氨酸。两种方法都可以用这些氨基酸作为内标（未列出数据），但方法2 肯定是首选方法。上述4 种氨基酸(EAA)都包含在安捷伦氨基酸辅助试剂盒(P/N 5062-2478)的标准品内。这些氨基酸用本文介绍的氨基酸分析新方法都可以完全分离。在快速分离高通量Eclipse Plus C18，2.1，3.0，或4.6 x 50 mm，1.8-μm色谱柱上的分离见图3 和图4。这两张图都包含内标正缬氨酸和肌氨酸，FLD 色谱图中的柱上浓度是100 pMole，DAD的柱上浓度是250 pMole，图中均有显示。添加EAA和内标的步骤已有报道[4]。这一步骤可用于绘制实际样品定量分析的内标校正表。这一步骤在实验部分已做介绍，并列于表2 和表3 中。

实际样品

　　图8 显示了各种窖装啤酒的比较结果。每种啤酒中均加入了500 pMoles/μL的内标，从而可以比较计算出的相对氨基酸含量。比较结果显示，这些啤酒的相对氨基酸含量与人们感觉并不一致，人们认为“普通”美国啤酒的氨基酸含量比传统德国啤酒要低。结果显示，至少有一些德国和英国啤酒生产商现在酿造符合美国口味的啤酒销往美国。有可能这种美国的微酿啤酒与为德国销售酿造的啤酒更一致，因为它的酿造符合德国纯度标准，因此，“传统的”德国酿造更有代表性。结果列于表7。

　　酸水解和后续的氨基酸分析在蛋白质分析中普遍使用。在实验室和目前生物技术和制药公司都在执行的新的过程分析技术(PAT)中，也对细胞培养基进行监测。有关这些领域氨基酸分析的文章将随后发表。

结论

　　本工作对氨基酸分析方法进行了各方面的改进。使用1.8-μm粒径色谱柱可使分析周期缩短一半，从35分钟左右缩短到13.5 分钟左右。最早洗脱的天门冬氨酸和谷氨酸的峰形都得到了改善。提高了二级氨基酸，以及反应最慢的氨基酸，如赖氨酸的重复性。线性良好（r² 接近1），平均峰面积重复性低于2%。报道了各种内径（ 从2.1 到4.6 mm） 的新快速分离高通量Eclipse Plus C18，1.8-μm柱的使用。新的流动相和进样器条件非常简单，只要简单地改变流速就可以在2.1-到3.0-或4.6-mm 内径柱之间进行转换。也可以使用快速分离高通量Eclipse Plus C8 或快速分离高通量Eclipse XDB-C18 或-C8 柱（数据未显示）。