用高分离度快速液相色谱对三七进行快速、高效分析

前言

　　中药（TCMs）具有悠久的用药历史，其疗效在中国及韩国、日本等亚洲国家都得到公认。在西方国家，也越来越普遍地将中药作为食品添加剂或营养补剂。被使用过的中药已经有11,000多种。对中药的研究和质量控制很大程度上依靠仪器分离和分析的性能。

　　本研究建立了一种分析三七的高分离度快速液相色谱(RRLC)方法。用安捷伦方法转移器轻松地将常规HPLC分析方法转为RRLC方法。用不同提取方法从三七植物的不同部位制备不同样品。用优化的方法分离这些样品，得到的色谱图显示了不同的色谱峰轮廓。本应用报告还报道了定量结果。质控部门使用本研究中建立的更快、更好的方法，将缩短分析时间，提高样品通量。使用这些方法还能节省溶剂消耗，改善整个分析过程。

　　三七，中文名三七或田七，在中国是一种重要而昂贵的药材。它已经有400多年的栽培历史，85%以上的三七都产自中国云南省。三七的功效在于促进血液循环、去除血液瘀积包括凝血，治疗肿胀、缓解疼痛。最近的药理学研究显示，三七具有抗癌和保肝作用，如，对心血管和脑血管系统有保护作用1。三七的皂甙种类与著名的人参和西洋参(花旗参)相似，因为它们都属于同一种属。三七主要用于中国南方的不同验方。著名的中成药云南白
药和片仔癀中也含有三七。

　　中药的复杂基质常常给质量控制和研究带来挑战。2005版中国药典收载了药材三七及其复方制剂，如三七伤药片，其中含有三七皂甙R1，是这些制剂中必须分析的成分。三七皂甙的分析时间一般是60 多分钟。随着对中药的研究越来越深入，科学家们认为只控制1 到2 个成分还不足以确定中药的质量，必须开发分离更多组分的质量控制方法。像中药这种复杂样品的分离比合成药物的分离需要更长的分析时间。当需要考虑样品通量问题时，理想的解决方案就是在较短的分析时间内达到相似或更高的性能。使用RRLC有可能开发出分析时间更短、性能更好，又节省溶剂的方法。对于生产质量控制来说，使用RRLC意味着产品批次的检定出厂可以比使用常规HPLC方法更快。

实验

仪器
　　用于开发RRLC 方法的Agilent1200系列高分离度快速液相色谱系统包含以下组件：

　　Agilent 1200系列RRLC系统包括：
　　• Agilent 1200 系列SL型二元泵，带真空脱气机
　　• Agilent 1200系列SL型高性能自动进样器
　　• Agilent 1200 系列SL型柱温箱
　　• Agilent 1200 系列SL型二极管阵列检测器，配置微量流通池(2 μL体积，3 mm光程)
　　• Agilent 化学工作站B.02.01SR1，用于数据采集和分析
　　• Agilent ZORBAX XDB C18 RRHT色谱柱，4.6 x 50 mm, 1.8 μm粒径

　　常规HPLC为标准配置Agilent 1100系列液相色谱，包含以下组件：
　　• Agilent 1100 系列二元泵，带脱气机
　　• Agilent 1100 系列自动进样器
　　• Agilent 1100 系列柱温箱
　　• Agilent 1100 系列二极管阵列检测器
　　• Agilent ZORBAX SB C18色谱柱，4.6 x 50 mm, 5 μm粒径

样品和样品制备
　　• 三七皂甙R1、人参皂甙Rg1和人参皂甙Rb1标准品购自中国国家药品与生物制品检定所(NICPBP)，人参皂甙Re和人参皂甙Rc 标准品购自美国Sigma-Aldrich公司。
　　• 三七茎叶提取物(NCLE)由用户实验室提供。茎和叶用60%乙醇提取，溶剂蒸干后残渣用正丁醇溶解，再将溶剂挥发掉，残留黄色粉末用甲醇溶解，待进样。
　　• 三七根提取物（NRE）由用户实验室提供。粗品用水提取，用大孔滤膜过滤，滤液挥发至干。残留白色粉末状物质用甲醇溶解，待进样。
　　• 三七购自当地一家药材商店（品牌为同仁堂）。粗品用水/甲醇(30/70, v/v)超声萃取30 分钟，用0.22微米滤膜过滤，用澄清的滤液进样。
　　• 水、乙腈和甲醇均购自美国Fisher公司。

方法转换
　　需要将使用填充5 μm填料色谱柱的常规HPLC方法转换成使用填充1.8 μm填料色谱柱的RRLC方法。使用安捷伦方法转换计算器( 可用光盘，Agilent 1200系列高分离度快速液相色谱系统，发行号5989-5130EN)，可使这一过程简便、快速(图1)。方法转换计算器上列出了各种不同参数，可以根据具体需求对转换后的方法进一步改进。如需了解如何将一个常规HPLC方法手动转换成RRLC方法，请参阅安捷伦相关应用报告2,3,4。

结果与讨论

色谱图
　　药理学研究结果显示，三七植物的不同部位因所含的成分不同具有不同的药效。使用特殊的提取方法以达到获得更多有效成分的目的。用常规HPLC方法和RRLC方法分析三七样品得到不同的峰轮廓。图2显示了用常规HPLC方法分析三七茎和叶提取物(NCLE)得到的色谱图。这种分析通常需要60多分钟5。如实验部分所述，用于分析三七样品的RRLC方法是在常规HPLC方法的基础上开发的。用常规HPLC方法和RRLC 方法分析了相同的NCLE样品。色谱图见图2 和图3。图3 中的色谱峰比图2 中的更窄。这意味着分离复杂样品的峰容量增加了。RRLC分析的分离度或分离性能优于常规HPLC。同时，分析时间从60分钟明显缩短到20分钟。另一个要考虑的因素是常规HPLC和RRLC柱的选择性应保持一致。如果新的RRLC柱与常规HPLC柱相比具有完全不同的选择性，方法转换将失去意义。在本研究中，峰轮廓和洗脱顺序都相同，所以不需要再对新色谱图中的峰进行鉴定。而且，二极管阵列检测器得到的UV光谱图将有助于进一步对色谱峰进行确证。

　　图4 显示了用RRLC 方法2 分析NCLE样品的色谱图。流速提高到1.5 mL/min，又缩短了分析时间。同时，保持了与图3 结果相同或相当的性能。对于更复杂的样品，缩短分析时间意味着将损失峰容量。所以，用户必须在峰容量和分析时间之间进行权衡。

　　如实验部分所述，有三种不同来源的样品。图3显示了用RRLC方法1对三七根提取物(NRE)样品的分析。样品为用不同的方法从三七根中提取。色谱峰轮廓显示，NRE 和NCLE含有不同类型的皂甙和其它成分。

　　为了检验所建立的RRLC方法是否能用于其它三七样品，我们从当地的一家中药店中购买了三七。品牌为同仁堂，中药店已将三七研成粉末。三七分析的色谱图见图6 和图7。图6 用RRLC方法1 获得，图7用RRLC方法3获得。与需要60多分钟的常规HPLC方法相比，图7中色谱图的分析时间只有4分钟。

　　三七茎和叶的提取物比其它样品更复杂，为了节省时间并保持分离度，用方法1 或2 分析。对于不太复杂的样品，如同仁堂的三七提取物，可以在更短的时间里用更快的方法分析，如图7所示。

定量结果
　　用RRLC方法2 分析实验部分所列的标准品。使用不同浓度水平的标准品绘制校正曲线，并测定了三个样品的浓度。表2显示了定量结果。NCLE含有许多种皂甙，但不含Rc或Re。NRE含皂甙种类较少，但含有本研究所分析的5 种标准品。同仁堂三七提取物中没有许多种类的皂甙，也不含Rc 或Re，R1、Rb1和Rg1的浓度比NCLE和NRE高。所有样品中三七R1的浓度范围为0.029 到0.89 μg/μL。本研究中建立的定量方法可以很容易地用于不同提取方法三七的质量控制。

结论

　　中药是复杂的天然产物，用常规HPLC进行分析需要高性能的系统和很长的分析时间。本研究中建立的RRLC方法显示了在保持复杂组分良好分离度的同时，如何缩短了分析时间。色谱图显示了不同三七提取样品具有不同的峰轮廓。考虑到应用的需要，使用更快流速的RRLC可得到更快的分析方法。本研究中建立的定量方法可以很容易地开发为三七产品的质量控制方法。用RRLC方法在保持或获得更高性能的同时，显著缩短分析时间，从而提高样品通量，节省经费。