使用LC／MS／MS 测定食品中的黄曲霉素

引言

　　黄曲霉素（AFs）属于真菌的次级代谢产物，是一类结构非常类似的化合物。这类霉菌毒素主要是由Aspergillus flavus 和A. parasiticus 产生的毒性非常强的代谢产物，人畜接触后可能致癌[1]。根据流行病学证据，世界卫生组织和美国环境保护署将黄曲霉素划分为人类肝脏致癌物。因此，为了避免接触黄曲霉素使人致病，并且提高世界范围的食品监督水平，有必要对其进行准确测定。对食品中黄曲霉素的常规检测是通过薄层色谱法（TLC）和液相色谱法（LC），以荧光检测（FD）结合柱前衍生化和柱后衍生化进行的。由于这类方法的高选择性和灵敏度，LC/FD 技术得到了常规使用。此外，联用技术在食品的残留量分析方面得到了开发和应用，如LC 与质谱（MS）检测器联用技术。质谱检测的高选择性和
灵敏度与液相色谱法的分离能力相结合，对较大分子量范围的物质在痕量水平进行定性和定量分析具有决定性的优势。一些阐述不同类型的质谱方法用于黄曲霉素分析的论文已有发表[2-4]。

实验部分

样品预处理

　　待测样品（花生、玉米、肉豆蔻和红椒）来自当地市场并且不含任何黄曲霉素。按Tanaka[5]报道的经过验证的方法进行了黄曲霉素的提取和清洗步骤。简单地说，取样品细粉20g，置200mL 锥形瓶中，对于玉米和谷类，加乙腈-水（9:1, v/v）40mL。振摇30分钟后，取该混合溶液以1,650 g 离心5 分钟。取上清液，用GF/B 级玻璃微纤维滤器（WhatmanInternation Ltd, Maidstone, 英国）滤过。取滤液5 mL，用MultiSep 228 号卡套柱进行样品净化。以1 mL/min 的流速过柱后，收集最初的2 mL 洗脱液。将洗脱液置40 ℃以温和的氮气流进行干燥。取残渣，用含有10 mM 醋酸铵的甲醇-水（4:6 v/v）1 mL溶解。

标准溶液制备

　　取黄曲霉素G₂（AFG₂）、黄曲霉素G₁（AFG₁）、黄曲霉素B₂（AFB₂）和黄曲霉素B₁（AFB₁）等标准试剂，分别用乙腈溶解并制成1 mg/mL 的溶液，置暗处于4°C 保存备用。等量吸取上述各种贮备液至一样品瓶中，以流动相稀释并制成LC/MS 分析用工作标准溶液。每种黄曲霉素的最终浓度为1 ng/mL。

化学品

　　标准物质AFG₂、AFG₁、AFB₁ 和AFB₂ 来自SigmaAldrich Japan（东京，日本）。这些化合物的纯度大于99%。醋酸铵、甲苯、HPLC 级乙腈和HPLC 级甲醇来自Wako Chemical（Osaka, Japan）。水为实验室内部以Milli-Q 系统（Millipore, Tokyo, Japan）纯化而得。MultiSep 228 号卡套柱购自Showa Denko（Kanagawa, Japan）。

LC/MS 仪器

　　本文中使用的LC/MS/MS 系统包括Agilent 1200 系列真空脱气机、二元泵、多孔板自动进样器、柱温箱、带有电喷雾离子源（ESI）的Agilent G6410 三重串联四极杆质谱仪。方法研究的目的是为了获得测定食品中黄曲霉素的快速而且灵敏度高的定量分析方法。
对不同的试剂和色谱柱进行了优化，以获得最佳的色谱分离度和灵敏度，发现使用水、甲醇、醋酸铵的一种简单溶剂系统和1.8-μm 粒径的C18 柱有很好的效果。

LC/MS/MS 方法

　　使用MRM 方式进行定量分析。MRM 的参数见表1。

结果与讨论

MRM 的优化

　　通过使用单级MS 全扫描模式及随后的子离子扫描模式对1 μg/mL 的黄曲霉素标准混合液进行分析，实现了对每种黄曲霉素最佳MRM 的测定。这些标准混合液在全扫描模式和子离子扫描模式下的质谱见图1和图2。全扫描模式下，各种黄曲霉素的质谱均显示质子化分子[M+H]⁺ 为基峰离子。选择这些离子作为MRM 模式的母离子。各个化合物的最佳碰撞能量不同。为了确定最佳碰撞能量，将该参数从5 V 变化至40 V，间隔为5 V。如图2 所示，观察到30 V 时，各种黄曲霉素的子离子强度明显最佳。各种强度最大的子离子分别为m/z 245（AFG₂），243（AFG₁），259（AFB₂）和241（AFB₁）。在上述结果的基础上，碰撞能量设定为30 V。

　　表1 显示每种黄曲霉素MRM 模式的参数。

　　各种0.1 ng/mL 黄曲霉素的MRM 色谱图如图3 所示。这些色谱图显示了所有黄曲霉素均具有出色的信噪比（S/N）。各种黄曲霉素的检测限以该MRM 色谱图信噪比的3 倍测得，如表2 所示。为评价校正曲线的线性，对从0.1 ng/mL 到100 ng/mL 不同浓度的黄曲霉素标准溶液进行了分析。如图4 和表2 所示，所有黄曲霉素的线性均非常好，相关系数（r²）均大于0.999。

　　通过在谷类和玉米提取物中注入0.2 ng/mL 的霉菌毒素标准品，对本方法的基质效应进行了考察。谷类和玉米提取物的典型MRM 色谱图分别如图5 和图6 所示。与霉菌毒素标准品混合溶液相比，未见两种食品样品基质带来的其它色谱峰。这些结果显示，MRM模式具有非常高的选择性。

　　此外，与黄曲霉素标准品的色谱峰强度对比，考察了样品基质中各种黄曲霉素峰强度的变化。结果如表3所示，各种成分的相对峰强度为88%-96%。因此，基质效应（如离子抑制）可能不显著，并且可能使用外标代替与基质相匹配的标准品。

结论

　　本文中阐述的使用LC/MS/MS 测定多种黄曲霉素的方法适合于测定谷类和玉米提取物中的四种黄曲霉素，灵敏度高，选择性强。该方法的另一优点是对于所有研究的食品样品，未发现离子抑制。因此，无需与基质相匹配的标准品，这使得对不同来源样品的分析方法更趋一致。