用微型化装置提高生命科学中的分析速度

通过仪器的更加小型化、集成化以及更少的花费和更高的分析速度，芯片实验室(lab-on-a-chip)概念促进了化学分析的变革。通过基因分析和高通量筛选中的应用，本文介绍了小型化复制的塑料仪器中的电泳分离性能。研究表明，其结果与传统测定的结果是一致的。

The lab-on-a-chip concept will contribute to a revolution in chemical analysis by making tools smaller, more integrated, less expensive, and faster. In this article, the performance of electrophoretic separations in miniaturized replicated plastic devices is described for applications in genetic analysis and high-throughout screening. The results of these stucties are shown to be consistent with those from conventional measurements.

        近年来，小型化化学分析系统引起广泛关注。与计算技术小型化类似，芯片实验室(lab-on-a-chip)的概念激发了化学分析的变革：使仪器更小、集成度更高、价格更低、分析速度更高。这种装置可能像人手那样大或更小，通常比目前试验室的小型装置更小。整个分析过程都能够在这种小型化、集成化和自动化装置中完成。该系统能够有效地改善传统实验室分析速度低的不足，同时由于制备成本较低，也节约了分析成本。因此。用该装置实现低成本高通量分析成为可能。除了能够实现快速分析之外，对于体积小的复杂样品而言，芯片实验室装置能够减少人为误差、避免污染并能带至现场应用。潜在的应用领域包括高通量筛选、环境监测、临床检验、空间生物学、原位(point-of-care)诊断、生物战争试剂检测、高通量DNA排序和基因组合等。第一例高度微型化的分析系统是将GC集成于平板芯片上^[1]。由于该芯片分析系统所需样品量非常少，所以特别适于生化和化学检测。本文中，作者将介绍在复制的塑料LabCardTM微型化电泳装置(AClARA BioSciences，Mountain View，CA)上进行基因分析和高通量筛选。

1 微型化塑料电泳装置

　　聚合物制造技术已用于在塑料基质平板上制备微通道用于电泳分析。塑料LabCard装置就是在固体基质(玻璃、硅、镍)上面通过注塑模、压模、铸模或热塑等方法精确制备微通道。固体基质可通过直接化学腐蚀材料，对于镍基质也可通过电镀镍等直接刻蚀得到。用另外的平面塑料将这些热塑或铸模覆盖，两者之间通过热熔或胶粘密封，覆盖层厚度可与模基相同或不同。本文介绍的分析结果均为在丙烯酸基聚合物模制备装置上获得。电泳是生命科学研究中应用最多的分离分析方法之一。这种方法基于在电场作用下荷电分子的移动来完成分离，电泳能够分离不同荷质比的分子(在原始状态下的蛋白质)或荷质比相同但分子量不同的分子(如DNA片段)。近年来毛细管电泳(CE，在熔融石英毛细管中充入缓冲溶液)提高了分离速度。平板、微通道装置在CE基础上又进行了改进。毛细管和微通道装置的电泳通道相似，但微通道的平板型交叉通道比单一的毛细管电泳通道更复杂，功能更多。例如。交叉通道装置能够注入比传统CE更少的样品注射量，由于注射样品宽度狭，所需分离长度减少，分离速度更高，但分离度并没有降低。

2 基因分析中DNA的分离

　　电泳是核酸分析中最主要的技术，如人类和其它动植物的基因序列是通过电泳分离分析DNA片段得到碱基序列的。此外，电泳也用于基因图谱确认，包括人的特性鉴别、表达分析、病菌分析、突变检测、药物研究等。随着人类基因组项目的完成，研究方向转向单个药物，DNA分析市场有望继续快速发展。因为核酸片段的荷质比与长度无关，所以传统的核酸分离，是在作为一个筛子的缠结聚合物溶液中基于片段大小进行分离的。图1是在微通道中快速分离常见不同分子量的DNA片段的电泳图，DNA片段之间相差100个碱基对。为了检测DNA片段，把染料添加到聚合物筛分介质中，染料嵌入DNA片段结构中后，能够被激光激发发出荧光。上述DNA片段在半分钟内就能完全分离，分离通道长度只有2mm，而在传统电泳或平板电泳中完成分离至少要半小时。采用该系统，在稍长的通道中也能够基线分离长度仅相差1．3％的双螺旋DNA片段，分离时间不到6min^[2]，该项分离可用于人的特性确认。多通道塑料LabCard也能在性能复杂、前后重复的等位基因(人与人之间长度不同的基因部分)图谱的高通量检测中得到应用[3]。

　　塑料微通道装置也可用于分离DNA序列。在这种分离中，要求能够分离长度仅相差一个碱基(如1000个中相差1个碱基)的片段，以便确认碱基序列。能够从分离谱图中读出的碱基的最大数目称作阅读长度。目前，确定的碱基最大数目达到600，30min完成，准确率达99%^[2，4]，而用商品自动测序仪完成相应的任务则要几个小时以上。

3 以电泳为基础的高通量筛选酶分析

　　为了加快新药开发，近几年高通量药物筛选是迅速扩展的领域^[5]。与传统技术相LL，微流技术在该领域具有非常突出的优势：明显减少样品用量、精确快速定量和流线型的化学体系^[6，7]。对于这些优势。LabCard系统均能满足，并且其低成本高容量的优势极大地满足了药物开发的需要。除此以外，由于药物筛选的目标是生物分子(酶、受体等)，它们在装置上的吸附是值得注意的问题，而LabCard装置的惰性表面则为药物筛选提供了一个极好的平台。

　　在高通量药物筛选(HTS)中，高准确度和快速非常关键。通过典型的酶分析可以证明微通道电泳装置的速度和准确度。该装置是利用荧光标记基质与酶、激酶和实验室未知化合物反应，通过电泳分离荧光标记基质和产物，用产物和基质相对峰面积确定未知化合物是否对激酶活性有抑制作用。图2是多通道塑料LabCard装置上典型的酶分析变化图，第一个峰是内标，用于检测通道尺场有望继续快速发展。因为核酸片段的荷质比与长度无关，所以传统的核酸分离，是在作为一个筛子的缠结聚合物溶液中基于片段大小进行分离的。图1是在微通道中快速分离常见不同分子量的DNA片段的电泳图，DNA片段之间相差100个碱基对。为了检测DNA片段，把染料添加到聚合物筛分介质中，染料嵌入DNA片段结构中后，能够被激光激发发出荧光。上述DNA片段在半分钟内就能完全分离，分离通道长度只有2mm，而在传统电泳或平板电泳中完成分离至少要半小时。采用该系统，在稍长的通道中也能够基线分离长度仅相差1．3％的双螺旋DNA片段，分离时间不到6min^[2]，该项分离可用于人的特性确认。多通道塑料LabCard也能在性能复杂、前后重复的等位基因(人与人之间长度不同的基因部分)图谱的高通量检测中得到应用^[3]。

　　塑料微通道装置也可用于分离DNA序列。在这种分离中，要求能够分离长度仅相差一个碱基寸可能的偏差及注射过程性能。产物、基质和内标物在7．5s内分离。本实验中，培养与分析过程在同一块板上进行，如果培养与分析过程独立，总分析时间的限制将不再取决于培养，而受分析时间限制。

　　分离药物筛选方法最重要的优点是能够清楚地定量检测，因为分析过程中基质改变能够完全与分离峰相关联。图2显示的激活酶分析就是一个极好的例子。基质和产物的基线分离，使其容易准确定量。在大多生化分析中，生物分子结构会改变，因而也会改变分子的电泳淌度。电泳淌度的改变在电泳分析中是必需的。

　　为了对LabCard分析方法与传统方法进行比较，作者选用了已知抑制效率的适当化合物，测定IC50(反应能力被抑制50％的浓度)。反应过程在LabCard装置上和在试管中反应后进行分析，得到的IC50值均为0．5?0．6μmol／L(图3)，与传统方法侧得的0．5pmol／L结果相当。检测了10多个化合物，其一致的结果表明，这种装置适合作为药物筛选工具。

4 结论

　　本文列出的几例证实了在可复制的塑料LabCard微通道装置上快速电泳分离可在2个领域应用：基因分析和高通量筛选。在未来几年，LabCard装置会集成更多的结构，实现样品?结果装置(sample-to-answer)或集成实验室装置(labs-on-a-chip)。

参考文献:

1. Teny SC, Jerman JH, AngeU JB. IEEE Trans Electrbn Devices 1979;ED-26: l 880-6.

    2.   Sassi AP, Ricco AJ, Hooper HH. For electrophoresis,smaller is faster. Todays Chem Work 2000;Feb:52-7.

    3.   Sassi AP, Paulus A, Cruzado ID, Bjomson T, Hooper HH. Rapid, parallel separations of DIS80 alleles in a plastic microchannel chip. J Chromatogr A 2000;accepted for publication.

    4.   Tan H, Williams SJ, Kao P, et al. DNA sequencing on microfabricated plastic chips. Saarbrucken, Germany.HPCE 2000, oral presentation LO57.

    5.Brush M. Automated laboratories: high throughput technology picks up stream. Scientist 1999;13:22-5.

    6.Gibbons I. Micronuidic arrays for high-throughput submicroliter assays using capillary electrophoresis.Dnlg Disc Today 2000;(HTS supplement) 1:33-7.

    7.Cohen CB, Chin-Dixon E, Jeong S, Nikiforov TT. A microchip-based enzyme assay for protein kinase A.Anal Biochem 1999;273:89-97.