基于模块化的96孔模式发展起来的固相萃取SPE方法

本文针对固相萃取方法发展的进展情况作一综述，该方法有助于高通量实验室操作实现流水线型。该系统将SPE柱插入标准96fL基板以加速和简单化SPE过程。同时利用该系统筛选吸附剂类型，有效地从血清中萃取出萘普生(naproxen)。数据清楚地指明了提供好清洁度和高回收率的条件。

An advance in solid-phase exffaction method development that helps streamline high-throughput laboratory operations is described. The system employs SPE carUidges that can be insened into a standard 96-well base plate to speed up and simplify the process. To demonsuate the use of this system, various sorbent types were screened for the effectiveness in thle exuaction of naproxen from human senlm. The data gathered in the investigation clearly identify the conditions that provide good cleanup and high recovery.

        每18个月计算能力和速度大约翻一番，这种现象如此有规律以至于成为众所周知的“Moore规律”。它经常被引用为技术节奏指数增加的指标。虽然长期内持续增长的例子少见，但技术突然增长的例子比比皆是。现以一家大药业公司为例：在1934年至1994年这60年内，科学家们在寻找新药过程中合成并筛选了约250，000种化合物仅从1995年起的几年内，他们就筛选了4500，000种化合物^[1]。这表明筛选速度以360多倍增长??比“Moore规律”大约快10倍。样品处理节奏的增长速度是惊人的。为了满足对更高通量的日益增长的要求，将过程所有方面(从样品采集到数据分析)集约化至关紧要。分析学家手头有强大的新仪器和技术，并且大多数情况下他们必须改进样品制备步骤，以及有时需重新定义优化条件。本文旨在阐明高通量实验室中固相萃取(SPE)方法发展，同时介绍一种将该关键过程集约化的工具。

1 96孔板模式的SPE

　　96孔板模式的SPE装置自从1996年出现已经在高通量实验室得到了广泛的应用和认可。在很大程度上，这主要归功于一个事实96孔模式(8x12孔，中心间距为9．0mm)已经用于生物技术和药物实验室的筛分、稀释和传递，以及其他与SPE无关的高通量操作^[2]。在自动化装置上，通过微型化将传统笨重的SPE柱插人其中。自动化装置生产商声称：液体处理工作站的产量以5倍的速度增长^[3]；96通道的吸移管管理器萃取能力己超过1000样品／h^[4]。LC-MS在药物实验室里的盛行加速了该模式的应用。该项强大的技术使得样品分析时间大大减少，这样样品的制备就走向一个更明显的“瓶颈”。96种样品的一次性平行处理是提高样品制备产量的一个明显、有效和易行的措施。

　　虽然96孔板SPE增加样品量的能力不容置疑，但其并不是没有缺点。其中最主要的是方法发展的问题。理想上，方法发展过程涉及筛分各种各样的与萃取效率和选择性有关的吸附剂、优化床层量以及决定使用的溶剂和溶液的最优组成和体积^[5]。实际上，SPE方法发展具有偶然性，因为不好的方法发展会部分地、暂时地被有选择性和灵敏性的检测器所掩盖。以下的分析问题经常可追溯至不充分的SPE方法发展：不重复的回收率、不充分的离子化或分解、加合物形成、LC柱阻塞以及精密仪器接口阻塞。而在96孔模式下，能够方便地检查方法发展，这是因为适合短时间内处理大量样品的模式对于少量样品处理显得很笨拙、繁琐。

2 96孔SPE方法发展中问题的解决

　　两个问题常困扰着96孔SPE方法发展第一个问题，在典型单板上筛分各种各样吸附剂和床层物质是不可能的。在方法发展中进行操作这个十分初始的步骤仅需要许多萃取板中一个萃取板上的少部分孔，这将是十分昂贵、费时且无用，分析学家经常通过在标准SPE柱上而不是在96孔萃取板上发展方法，以便绕过该步骤这又会带来在96孔SPE方法发展中经常遇到的第二个问题：将标准SPE柱上方法转移到96孔板上并非区区小事，标准柱和孔板在填料和吸附剂床层大小上的差异会导致在方技行为上的重要差别，要想使96孔SPE方法接近有效的标准柱方法，必须经常进行耗时的重新优化步骤。此外，SPE吸附剂[dbsl]生产商没有提供床层物质在50或100mg以下标准柱，但在96孔板中床层物质量低至10和25mg是很普通的。在方法发展中若使用标准柱，这将有可能评价一些有潜在用途的96孔吸附剂和床层物质。

　　VersaPlate 96孔SPE系统(Varian，Palo Alto，CA)克服了传统的单片96孔SPE板的局限性，并且集约了方法发展过程以实现高通量。该系统SPE柱很容易插人96孔板(如图1)。这有助于快速定制96fL板结构，最终简化且加速了方法发展过程。Luer-针头管使得VersaPlate管既可用于96孔模式，又可带有标准SPE柱的真空多支管模式。得出的产品既可整合在一起，又可作为单一组分。

3 高通量方法发展：单板吸附剂筛选

　　为了表明集约化的96孔SPE方法发展系统的可行性， 我们通过萃取人血清中萘普生(naproxen)来筛选吸附剂。Quadra 320移液管控制器(Tomtec，Hamden，CT)提供了高效的移液能力。现评估8种不同的吸附剂，在一个单独的96孔板上每一种都采用三种不同床层质量。图2为VersaPlate柱和基板的组合。由于大多数非极性SPE方法的简便性、通用性、快速和与生物基体的兼容性，所以筛选采用非极性机制。

　　一个极性的弱阴离子交换吸附剂氨丙基[aminopropyl(NH2)]，在筛分过程中也得到了评价。极性或离子交换能有非极性相互作用，且较其非极性对应物选择性更大。因此，一般和较传统的非极性吸附剂一起评价这些吸附剂^[6]，是基于其简单性和通用性来选择最初的SPE方法。用强的和弱的洗脱剂来筛选，能更好辨别不同吸附剂和床层质量间回收以及洁净度的差异(如果回收率或萃取洁净度达不到最佳，那么方法发展早期引入复杂的洗脱方案会导致费解的故障排除)。含有萘普生(naproxen)(200μg／L)的血清样品(1mL)用浓磷酸(20μL)酸化，在如图2所示的VersaPlate 96孔板依据表1的程序进行萃取。所有的添加和传递都是用VersaPlate多只管上的Quadra 320移液管操作的。操作单个VersaPlate的时间不到15min。萃取物和倍他米松(betamet-hasone)(30μL的20mg／L甲醇溶液)混合，在Inertsil (GL Sciences Shinjuku，Tokyo，Japan)5 ODS-3 HPLC柱(150mm x 4．6mm)上，采用0．1％磷酸／乙腈(60：40)为洗脱剂，流速为2mL／min，240nm紫外检测。
 

4 结果与讨论

　　所有萃取物的纯净度都可以接受(没有干扰物和素普生(naproxen)或内标一起洗脱出)。图3为样品色谱图图4为单板吸附剂筛分的平均回收率。正如所料，一些吸附剂／床层物质的结合产生了更好的回收率。这些差异是由各种各样的因素引起的，比如吸附剂对分析物的吸附容量、干扰结合的程度、分析物和吸附剂间的作用强度(与吸附容量相关)以及在典型吸附剂萃取条件下样品基质的效应。在方法发展过程中，分析学家必须对低回收率或差的纯净度作出合理的估计，然后通过调整方法参数来克服这些通常，几乎没有可利用的数据指导分析学家。然而，上面所提到的单板吸附筛选能提供重要的线索。筛选能够辨别出因容量对差的保留造成的回收率问题，提供给定的吸附剂／床层物质相结合的重复性的数据，并且提供与其它被评价的吸附剂和床层物质的纯净度信息。

　　以下的步骤将依赖于分析的目的。例如，从图4的数据可以得到一个好纯净度、高回收率、最短时间的萃取方法。在这种情况下，用于普通筛选方法的60mg NEXUS萃取柱能提供所有萃取所需的内容，包括好纯净度、高回收率和好的重复性。然而，不同方法目标针对不同的方法发展。比如，若方法发展目标是使洗脱体积最小，同时保证高的回收率，那么单板吸附剂筛选结果就针对不同的方法发展途径。在这种情况下，C2和C8吸附剂的回收率不如NEXUS的高，但是。观察到的回收率没有作为吸附剂质量的函数而显著增加，表明吸附容量不是问题所在。相反，低于最佳的回收率看来是由差的保留或洗脱所导致。这些有最小洗脱体积的吸附剂最有前途。在这种情况下，额外的方法发展集中在改进保留(例如，通过调节样品pH或稀释)或者硅胶为基质的非极性的吸附剂的洗脱效率(比如通过酸化洗脱溶剂来克服次要的硅羟基作用)。最重要的一点是已经找到了进一步优化的合适方向，并且，初步的吸附剂筛选和优化在一个早晨可以完成。

5 系统优点

　　VersaPlate系统使得科研人员可用多年来一直是色谱方法发展的基础的知识和技术，但要把这些技术和高速度结合成一个模式。这种方法的优点包括：

●方法发展的完全自动化提高了样品和溶剂处理的精确度和准确度。
●平行的方法发展使得所有的样品得到同样和同时处理。
●过程在几小时内而不是在几天内完成，能够更好地控制方法发展变量。
●方法发展和过程使用同样的仪器和SPE装置消除了过渡性的错误和重新优化。
●快速的方法发展过程，不需在关键步骤之间进行协调。随着对分析学家在保证分析质量下提高速度要求的增强，像这种能减少方法发展时间的灵活VersaPlate系统将变得更加需要。

参考文献:

1. Dagani R. Pittcon 2000. C&E News Apr 3,2000:37.
   
2. Wells DA. 96-Well plate products for solid phase extraction : LC-GC 1999; 17(7):600-10.
   
3. Packard Instrument Co. Appl note, LHA-013A. Meriden, CT 1998.
   
4. Tomtec promotional documents. Hamden, CT 1997.
   
5. Ingwersen SH. In: Simpson NJK, ed. Solid-phase exRaction: principles, techniques, and applications, New York, NY: Marcel Dekker 2000, chap 10.
   
6. Simpson N, Van Home KC, eds. Handbook of sorbent extraction technology Harbor City, CA: Varian Associates, 1993.