多重联用：液相色谱和多重谱学方法的联用

摘要：各种分析模式联用使分析化学家威力大增。本文主题是几种光谱仪与液相色谱仪的联用，构成一个集成系统，在单次分离过程中就能提供一套综合光谱信息。由这种多维技术创造了“多重联用”(“hyphenation”)这个术语。

Abstract: Coupled orhogonal analytical modalities add greatly to the power of the analytical chemist. The subject of this article is the linking of several spectrometers with a liquid chromatograph into one integrated system that provides a comprehensive set of spectroscopic information from a single separation. For this type of multiple hyphenation, the term hypemation has been coined.

      早在1980年，Tomas Hirschfeld在一篇深思熟虑、有洞察力的文章中讨论了分析中联用方法的作用，并特别强调了气相色谱和不同谱学方法的联用^[1]。尽管这在当时只是一个新的设想，但术语”多重联用”现在已被广泛看作是色谱系统和一种起检测作用并能提供谱学信息的设备的结合。本文的主题是讨论由不同的谱学仪器组成一个一体化的体系在一次分离过程中提供全面谱学信息的问题。对于这样一个多重联用方法，采用了术语”多重联用”以和单一谱学仪器的联用方法相区别。那么这一课题的特色是什么呢?近20年左右，联用技术如液相色谱-质谱(LC-MS)曾经是实验室里最需要并被认为是一定会出现的技术装备。的确，这个体系(指LC-MS)对药物实验室的改造是彻底的，以致在这些实验室里往往难以找到一台LC-UV(液相色谱-紫外光谱仪)或液相色谱-荧光光谱仪。LC-MS的广泛应用对样品中感兴趣的成分的鉴定有显著的影响，这些样品过去都要事先纯化后才能用谱学方法测定。

　　然而，且不论LC-MS的性能，它毕竟不能解决所有的问题。结构测定经常要用到核磁共振(NMR)谱。虽然LC-NMR装置不像LC-MS那样容易得到，那样普遍，但是它在解决实际问题中已经得到广泛应用。在药物、天然产物、合成化学、环境等方面已经有大量文献报道了LC-NMR的应用^[2]。LC-NMR和LC-MS尽管灵敏度有差别，但根据它们之间数据互补的本性，将它们联合为统一的联用体系是令人满意的。这种联用首次出现于1995年^[3]。紧接着其他课题组又报道了在一系列样品中的应用^[4]。能成功地将NMR、MS联接成一个统一的仪器装置，就不难添加UV-VIS(紫外-可见光谱)二极管阵列检测(DAD)方法，以获得紫外光谱方面的信息，由于通常把UV检测器都用作LC-NMR流出物的监视器，因而稍微升级就可做到这一点。现在，只需将FTIR(傅里叶变换红外光谱)仪组合到这个体系，该体系就将成为一个真正的传统意义上能提供全面结构测定数据的装置。

　　为了探索这个多重联用体系的潜力，近年来针对单个组分用流动注射分析(FIA)^[5，6]和结合一种或多种分离方法用于简单的混合物分离”^[7?12]进行了一系列研究。这些研究暴露了由这些谱学仪器联用所产生的实际问题。有些问题是显而易见的，如所需的溶剂系统，它应和所有的联用的谱学仪器相兼容又能进行不同样品的分离。另外，还有一些复杂的问题，如仪器的位置(特别是NMR波谱仪与众不同的磁场)；把所有仪器连接起来的管路；不同仪器对溶剂流速的要求；为获得谱图所需的样品量和对最后数据的收集(管理)和解释等。虽难易程度不一，但都需妥善解决。

　　近代的NMR、FTIR、UV-DAD和MS等仪器已经使它们和液相色谱的多重联用更加容易，即它们能与流动相和流速变化范围相适应。即使如此，仍然要细心地设计分离系统，例如要去除不挥发的缓冲盐类，以保证联用中MS有好的实验结果和NMR谱图中不变缓冲液和溶剂信号的干扰。

　　实际上，由乙腈和重水(D₂O)组成的流动相是个好的起点，通常使用氘代溶剂并不是必要的，尤其当乙腈在溶剂中的含量低于50％时。然而在某些情况下使用氘代溶剂则是有利的，例如当乙腈是溶剂中主要成分时(参见下面给出的非极性高分子添加剂分析实例)很难抑制溶剂的干扰。在被分析物的信号接近乙腈的甲基共振谱线的情况下，使用氘代溶剂可抑制溶剂(指乙睛)的干扰信号。

　　一系列不同的多重联用实验装置在作者的课题组组装，组装的指导原则一方面取决于课题组当时的现有仪器，另一方面也取决于要研究的样品类型。在所有这些实验装置中，基本上都采用了没有改装的、现成的商品仪器。理想情况的所有谱图都应来自流动条件下；在在线收集样品如IR和停流模式下的NMR进行谱学测量可提高灵敏度和信息量。这样做很费时间，但测量可完成得很精细。二维NMR实验在流动条件下是不可能完成的。停流条件下流出峰被保留在NMR的流动样品池里。另外，停流条件下还可得到较弱的样品谱图，在流动条件下因NMR相对低的灵敏度而得不到有意义的信号。因此联用装置的操作需要经常在样品分离和检测之间进行折中选择。

　　图1是作者最近组装的多重联用仪的布局^[12]，在这个体系里3个相对不灵敏的、非破坏性的谱仪IR、UV和NMR放在同一个分区，而MS所需的样品量很少，而且是一个破坏性的检测器，通过插在柱出口的分流器将其放在另一分区。由于MS的高的检测灵敏度，流出物约95％分流至IR、UV和NMR等谱仪，剩下的5％流到MS。并行连接的另一个理由是，当MS放在NMR后面时，可防止NMR的过压流动池的泄漏。MS平联安排还有个优点：对特定的流出峰可用MS触发NMR的停流实验，因为在流出峰进入NMR流动池之前已由MS获得该峰流出的信息。

　　就本文所述的一系列谱仪而言，联用后，灵敏度通常较低，如IR或NMR仪等。对于这样一个特定的体系，评估其灵敏度时必须指出，对特定的色谱峰，要获得NMR谱图所需的样品量和许多因素有关，包括样品的分子结构、在NMR流动池停留时间??这个时间当然和流速有关、停流模式的选择以及流动池的体积等。同时还应了解体系中任何一个谱仪的检出限(LODs)和获得一个特征谱图所需样品量间的差别。在后者尚无一个确认的术语前，不妨提出谱学检出限(LOSI，the limit of spectroscopic identification)，它对应于定量分析中检测限(LOD，the limit of detection)和定量限(LOQ，the limit ofquantification)之间的差别。近期的有关研究详述如下^[10-12]：一个500 MHz的NMR波谱仪，作为在线流动谱仪，装有60μL的流动池，流速为0．5?1．0mL／min。对一个低分子质量的分析样品而言，LOD大约是10?20μg，而LOSI则为40?100μg。显然，如果采用停流技术，对于简单的一维NMR谱图则其所需的样品量将有所下降。FTIR的灵敏度和NMR相当。

　　实际上，在组装HPLC-N-谱仪体系时，有价值的第一步是和F队而不LC组装在?起。这样有利于观察不同谱学仪器联用时产生的问题，诸如如何优化流动、选择分流比、测定溶剂的兼容性以及不同谱学仪器对不同分析样品的灵敏度等，而不受色谱分离复杂性的影响。一旦这些因素确定后，则可引入色谱系统，只要溶剂系统经过仔细选定，一般不会产生太大的附加问题。事实上FIA系统是很耐用的，在上述实验基础上，联用的FIA无疑是很容易实现自动化的，并可在常规分析中鉴定测试前收集的化合物。FIA运行良好的理由之一是它不存在复杂色谱流动相所造成的困难，而这个困难有可能被重水或简单的氘代有机溶剂作流动相加以克服。

　　虽然和FIA联用是令人满意的，但更振奋人心的应是联用和分离的关系。在作者最新的体系里，在线流动的UV、IR、NMR和MS等谱仪已经用于药物、高分子添加剂及一系列含滋甾体的植物抽提混合物的研究。在药物和甾体混合物研究中一个令人注目的特点是采用过热重水作流动相 (即高于100℃的重水)。事实上，当温度升高时，水的行为更接近于一个非极性的溶剂，由此增加了它的洗脱强度。就联用而言，这有许多好处，因为它提供了一个简单的流动相，而且它很容易和联用中所有谱仪相兼容，它的干扰信号也远少于简单的二元溶剂混合物。过热水色谱法在恒定的流动相组成时，可以来用程序升温法，以确定一个液相色谱所需分离的有效的梯度(指温度梯度，即程升速率)一采用过热重水流动相，在色谱峰上获得的谱学信息的实例见图2。分析样品是20-羟基脱皮激素(结构列于图2)，它存在于植物Silene frivalskyana^[10]的抽提粗品中。这个谱图约需150μg源料。在所述条件下，100μg是NMR波谱仪和IR光谱仪测定的LOSI值。

　　然而，不论这个结果如何令人向往，过热水是不适用于极性相对较强的物质，更不会适用于所有的化合物的。采用所述体系研究了一系列高分子添加剂^[12]，这些添加剂都是些相对非极性的化合物，流动相有高的乙腈含量(约80％)。为了获得满意的NMR结果，采用了氘代的溶剂。作为一个例子，BHT(2，6-二叔丁基4-甲基酚)的测定结果见图3(列出结构式)。

　　上述实例表明，联用方法在技术上是可行的，而且LC-UV-NMR-MS体系已经有商品仪器。和作者课题组组装的原型体系相比，现在组装LC-UV-IR-NMR-MS体系是更容易，而且性能也更好。如果采用当代技术水平的各种谱仪，结合微内径液相色谱法，并仔细设计以压缩色谱峰的扩张等，那么用亚微克级样品量进行全谱学方法的测定将是不困难的。

　　这里的主要问题不是谱学方面的，而是如何控制各种谱学仪器(包括色谱仪)以及收集、询问、解释这个体系通过计算机得到的大量数据。要充分发挥联用体系的潜力，解决好数据处理问题是必不可少的。

　　做某些事仅仅在技术上可行，那绝不意味着一定是个好主意。本文一开始就引述了Tomas Hirschfeld^[1]的论文，看来引述他冰R-UV-NMR-MS联用可能性的意见是适当的，“用计算机以及必要的界面装置把它们组装成一个自动化的体系，显然而且肯定是可行的……当然可行性并不是把做某些事放在首要位置进行的充分判据。很难设想，把这些仪器组装成一个自动化体系的要求将在那里出现。”他接着说，”当人们谈论操作人员以人-机对话引导模式编制数据，进行从头开始的结构研究，如同一个定性识别的改良方法时，情况将完全不同。”这个观点在今天如同他首次发表时同样正确。过去20年发生的变化是我们最终组装了Hirschfeld 1980年论文中设想的装置，希望今后20年，分析科学群体能解决尚遗留的问题。

参考文献:

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