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双荧光素酶报告实验

荧光素酶报告基因检测的操作步骤

荧光素酶检测系统,可用裂解液来温和而快速地提取真核细胞中的荧光素酶,用其底物来检测荧光素酶活性。检测步骤如下:1. 加裂解缓冲液裂解转染的细胞。2. 将上述裂解物转移入微孔板或者试管中(根据检测的需要选择所用器材类型)。3. 加入含有所有酶反应成分(必须包括底物荧光素),使化学发光反应开始。4. 使用荧光仪或者液闪计数仪检测所发射的荧光。实验步骤:注:该操作流程通常用来检测转染了萤火虫荧光素酶基因的真核细胞中荧光素酶表达的活性,不适用于对细菌荧光素酶进行检测。1.实验第一天,消化并接种细胞(根据具体实验选择合适的细胞)于35mm细胞培养皿,置于5%co2、饱和湿度的37℃培养箱内培养过夜。2.等细胞密度达到70%时用luciferase报告基因质粒、lacz的表达质粒及其它质粒(根据具体实验确定)共转染细胞(根据具体实验选择转染方法,如磷酸钙沉淀法、pei、lipofectamine20......

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然后用1X Passive裂解液进行裂解,最后结合双荧光素酶报告实验系统和SpectraMax i3x读板机的注射器卡盒进行上述实验。实验前,用一张白色封膜放到微孔板底从而最大化检测信号。

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上游,构建成荧光素酶报告质粒。然后转染细胞,适当刺激或处理后裂解细胞,测定荧光素酶活性。通过荧光素酶活性的高低判断刺激前后或不同刺激对感兴趣的调控元件的影响。双报告基因载体系统以Luc作为启动子

 平台介绍:         荧光素酶是理想的报告基因。双荧光素酶报告基因检测系统中含有在同一细胞中同时表达的两种荧光素酶。共转染的“对照”报告基因作为内参对照,为试验提供基准值。实验报告基因经过