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时间分辨荧光免疫分析法测定甲状腺素
关键词：国家一级标准物质 农药多残留分析 标准样品 化学对照品时间分辨荧光免疫分析法测定甲状腺素
【实验原理】
甲状腺素(thyroxine，或3，5，3’5’-tetraiodothyronine，T4)检测采用竞争性时间分辨荧光免疫分析法。向二抗包被微孔板的反应孔中加入待测血清、铕标记T4和鼠抗T4的单克隆抗体(单抗)一起温育；样本中T4和铕标记T4竞争性与鼠抗T4单抗上的结合位点结合，形成复合物；同时，鼠抗T4单抗和包被在微孔板上的二抗结合；经温育后洗板后，加入解离增强液将标记在复合物中的铕离子解离至溶液中，与增强液中的有关成分形成荧光整合物微囊，产生的荧光强度与样品中的T4浓度成反比。
【试剂与器材】
购买成套的商品试剂盒，主要成分如下。
1．96孔微孔反应板 已包被第二抗体。
2．T4标准品 由6瓶组成，分别含有0nmol／L、20nmol／L、50nmol／L、100nmol／L、150nmol／L、300nmol/LT4标准品。
3．抗T4单克隆抗体 1瓶(0．75m1)。
4．铕标记T4 1瓶(0．75 m1)。
5．浓缩洗液(25×) l瓶(40m1)。
6．缓冲溶液 1瓶(30m1)。
7．增强液 l瓶(50m1)。
8．仪器 时间分辨荧光免疫分析仪。
【操作步骤】
1．试剂准备
(1)洗涤液：40ml浓缩洗液加960ml蒸馏水混合(pH 7．8)。
(2)铕标记T4：使用前1小时内配制，每条反应板需30μl铕标记T4加3ml缓冲液。
(3)抗T4单克隆抗体工作液：30μ1抗T4单抗加3ml缓冲液。
2．洗板1次，拍干。
3．吸取25μ1 T4标准品或待测血清按顺序加入微孔反应板的小孔中。
4．每孔加200μ1已稀释的铕标记T4和抗T4单抗工作液。用振荡器振荡90分钟，注意不要超过2小时。洗板4次，拍干。
5．每孔加入增强液200μl。加样过程中，尽量避免加样头碰到孔中的试剂，以免污染。微孔反应条在振荡仪上振荡5分钟，用时间分辨荧光检测仪检测。
【结果计算】（国家一级标准物质）
以T4标准品的浓度为横坐标(对数坐标)，荧光强度为纵坐标(普通坐标)，在半对数坐标纸上绘制标准曲线，根据样品的荧光强度即可查出相应的T4浓度。此步骤通常以时间分辨荧光测定仪按设定模式直接打印，报告结果。
【参考区间】
成人：69．0～141．0nmol/L。
【临床意义】
1．甲亢、T3毒血症、大量服用甲状腺素、慢性甲状腺炎急性恶化期、甲状腺结合球蛋白结合力增高症等患者血清T4值显著升高。
2．原发或继发性甲状腺功能减退，如黏液性水肿、呆小症，以及服用抗甲状腺药物、甲状腺结合球蛋白结合力降低、肾病综合征、重症肝病患者及服用某些药物(如苯妥英钠、柳酸制剂等)时血清中T4值显著降低。
【注意事项】
1．认真阅读说明书，严格按说明书操作。不同批号的试剂，过期的试剂不可使用。
2．实验室环境干净无尘，对于试验成功有决定性的意义。
3．每批检测时最好用复孔做标准曲线。
4．试剂和检样使用前应恢复至室温(18～25℃)。
5．洗板机应定期进行校正，保证管道通畅。洗涤时，确认微孔注满洗液；洗涤完成后保证微孔残留液不超过5μl；并将微孔板倒扣于无尘吸水纸上拍干。
6．加增强液及铕标记物时，请使用专用吸头，以避免污染。加增强液及中和抗原时，吸头应悬空，避免接触小孔边缘及其中的试剂。
7．使用干净一次性容器配制铕标记物，不同试验的铕标记物不可混用。避免铕标记稀释液进入铕标记物原液中。若对实验结果有疑问，应重复实验。
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