HPLC检测食品中L-抗坏血酸、D-异抗坏血酸及抗坏血酸总量
维生素C(又称L-抗坏血酸,化学名L-3-氧代苏己糖醛酸内酯),是一种天然存在的具有抗氧化性质的有机化合物,亦是一种维持人体正常活动不可缺少的营养物质。L-抗坏血酸分为还原型和脱氢型两种,其中还原型L-抗坏血酸极不稳定,遇空气中氧、热、光、碱性物质,特别是在有氧化酶及痕量铜、铁等重金属离子存在时,易被氧化成为脱氢L-抗坏血酸。L-抗坏血酸作为一种营养强化剂和食品添加剂广泛应用于食品加工和保健品行业中[1]。D-异抗坏血酸是L-抗坏血酸同分异构体,化学性质与L-抗坏血酸相似,抗氧化性较L-抗坏血酸佳,但生理活性极低,仅有L-抗坏血酸的1/20。D-异抗坏血酸作为食品抗氧化剂和肉制品的防腐助色剂,以及药品的辅助材料,应用于肉类罐头,啤酒,果汁果酱,冷冻水产品等食品中。但摄入过多也会使白细胞的抗病能力明显下降,会引起草酸及尿酸结石、腹泻、多尿、皮疹等。目前国内测定抗坏血酸的常见方法主要有荧光法、比色法和滴定法。荧光法操作繁琐且荧光读数不稳定;2,4二硝基苯肼比色法,易受试样杂质和颜色干扰,误差较大,且使用腐蚀性试剂硫酸和易爆试剂;滴定法易受深色样品的颜色干扰,灵敏度低,误差较大。而这些方法均只能测定食品中天然存在的或添加的抗坏血酸总量,无法分别测定同时存在的L-抗坏血酸和D-异抗坏血酸[2~4]。近年来,国内外有学者研究高效液相色谱(HPLC)检测抗坏血酸,成为了重要的研究方向和发展趋势[5~7],本文建立了一种简单快速、准确有效的HPLC技术,同时检测多种食品基质中L-抗坏血酸、D-异抗坏血酸及抗坏血酸总量。图1 L-抗坏血酸、D-异抗坏血酸和脱氢抗坏血酸结构式1材料与方法1.1材料与试剂L-抗坏血酸标准品,D-异抗坏血酸标准品(纯度99.7%以上,Supleco);偏磷酸,磷酸三钠,磷酸二氢钾,磷酸(分析纯,国药集团化学有限公司);L-半胱氨酸,十六烷基三甲基溴化铵(优级纯,Supleco);甲醇(色谱纯,Caledon)。偏磷酸溶液(20 g/L):称取20 g偏磷酸,溶于水定容至1 L。磷酸三钠溶液(100 g/L):称取100 g磷酸三钠,溶于水定容至1 L。L-半胱氨酸溶液(40 g/L):称取20 g L-半胱氨酸,溶于水定容至500 ml,临用时配制。1.2仪器与设备Agilent 1200高效液相色谱仪,附二极管阵列检测器或紫外检测器;pH计(Professional Meter PP-50,Sartori-us);离心机(5810R,Eppendorf公司);超声波清洗器(EYELA MVS-10)。1.3实验方法1.3.1标准溶液配制L-抗坏血酸和D-异抗坏血酸标准储备溶液(1.0 mg/ml):分别称取L-抗坏血酸、D-异抗坏血酸标准品10 mg(精确至0.1 mg),用20 g/L的偏磷酸溶液定容至10 ml。临用时配制。标准工作溶液的配制:分别吸取L-抗坏血酸和D-异抗坏血酸标准储备溶液适量,用20 g/L的偏磷酸溶液逐级稀释成0.5μg/ml,5.0μg/ml,10.0μg/ml,25.0μg/ml,50.0μg/ml的标准工作溶液。临用时配制。1.3.2试样溶液的提取称取均质后的固体样品2 g,或吸取液体样品10 ml(含抗坏血酸约1 mg~3 mg)于50 ml离心管中,用20 g/L的偏磷酸溶液定容至50 ml,振荡后超声提取15 min,4000 r/min离心5 min,经0.22μm水相滤膜过滤,供HPLC测定试样中还原型L-抗坏血酸和D-异抗坏血酸的含量。1.3.3试样溶液的还原取20 ml试样溶液于50 ml离心管中,加入10 ml 40 g/L L-半胱氨酸溶液,用100 g/L磷酸三钠溶液调节pH至7.0~7.2,振荡5 min,将脱氢抗坏血酸还原为还原型抗坏血酸。再用磷酸调节pH至2.5~2.8,用水定容至50 ml,即得试样还原溶液。若试样含有增稠剂,吸取4 ml的试样还原溶液,加入1 ml甲醇混匀。试样还原溶液经0.22μm水相滤膜过滤,供HPLC测定抗坏血酸总量。样品尽可能在25℃以下、避光的环境中,于8 h内完成检测。1.3.4 HPLC色谱条件色谱柱:Kromasil C18柱,250 mm×4.6 mm,5μm;检测器:二极管阵列检测器或紫外检测器;流动相:A:6.8 g磷酸二氢钾,0.91 g十六烷基三甲基溴化铵,溶解在1 L水(pH2.5~2.8)中,B:100%甲醇,A+B(98+2);流速:0.7 ml/min;检测波长:245 nm;柱温:25℃;进样量:10μl。2结果与分析2.1 pH值对抗坏血酸还原的影响吸取1.0 mg/ml的L-抗坏血酸标准储备溶液2.5 ml于50 ml离心管中,加入10 ml 40 g/L的L-半胱氨酸溶液,用100 g/L磷酸三钠溶液调节不同pH值,测定其还原率(表1)。结果表明磷酸三钠溶液调节pH至7.0~7.2时,L-半胱氨酸的还原效果最好。表1 pH值对抗坏血酸还原效率的影响pH值6.5 7.0 7.2 7.5 8.0 9.0还原率(%)39.1 72.3 72.4 60.5 46.5 30.82.2振荡反应时间对抗坏血酸还原的影响吸取1.0 mg/ml的L-抗坏血酸标准储备溶液2.5 ml于50 ml离心管中,加10.0 ml 40 g/L的L-半胱氨酸溶液,用磷酸三钠溶液调节pH至7.0~7.2,通过振荡反应时间的不同,测试抗坏血酸的还原效率。结果表明振荡反应时间对还原效果的影响不大,振荡反应5 min就能够满足试验要求。2.3流动相的选择实验发现,流动相配比随着甲醇浓度的降低,L-抗坏血酸和D-抗坏血酸两峰分开,当甲醇比例为2%时,L-抗坏血酸和D-抗坏血酸两峰达到基线分离。而流动相pH值在4.0~7.0时,无法提供一个稳定的酸性环境,L-抗坏血酸和D-异抗坏血酸的出峰时间易发生漂移。流动相pH值调整在2.5~2.8时,抗坏血酸出峰时间时间稳定。图2 L-抗坏血酸和D-异抗坏血酸标准溶液色谱图(0.5μg/ml)2.4标准曲线及线性关系L-抗坏血酸和D-异抗坏血酸在0.5μg/ml~50μg/ml范围内均有良好的线性关系。L-抗坏血酸线性回归方程为y=16.24x-1.399,相关系数r=0.9999。D-异抗坏血酸线性回归方程为y=18.06x-4.34,相关系数r=0.9999。2.5加标回收和精密度实验对六种不同基质的试样进行添加回收试验,准确度和精密度结果见表2。表2食品中抗坏血酸测定的加标回收和精密度(n=6)样品本底值mg/100 gL-VC D-VC添加水平mg/100 gL-VC D-VC平均回收率(%)L-VC D-VC相对标准偏差RSD%L-VC D-VC乳粉1.750 ND 3.125 3.125 107.1 88.8 3.67 1.3731.25 31.25 97.6 91.7 1.28 1.35312.5 312.5 99.0 104.7 1.79 0.79肉干ND ND 3.125 3.125 92.4 87.5 4.64 4.7831.25 31.25 92.8 101.8 2.57 2.95312.5 312.5 96.4 101.1 3.15 3.08麦片1.569 1.731 3.125 3.125 109.3 91.4 4.67 7.0031.25 31.25 91.4 94.0 1.04 2.98312.5 312.5 94.9 103.9 0.20 1.46果汁0.279 ND 0.625 0.625 105.8 110.8 2.61 4.786.25 6.25 98.9 100.2 4.44 4.6162.5 62.5 96.2 97.2 0 0.99维生素片0.963 1.188 3.125 3.125 93.6 84.4 5.21 2.6231.25 31.25 93.7 90.6 2.79 0.60312.5 312.5 96.5 96.4 1.14 0.61蔬菜泥0.942 0.888 3.125 3.125 99.1 93.7 5.61 3.4931.25 31.25 102.0 92.8 3.32 2.37312.5 312.5 96.1 99.8 0.67 0.99注:ND:未检出。2.6检出限测定以信噪比(S/N)3作为检出限(LOD),固体样品的检出限为0.938 mg/100 g,液体样品的检出限为0.188 mg/100 g;以信噪比(S/N)10作为定量限(LOQ),固体样品的定量限为3.125 mg/100 g,液体样品的定量限为0.625 mg/100 g。2.7实际样品测试利用建立的高效液相色谱法,对配方奶粉、婴儿辅助食品粗麦奶糊粉、酸奶糊、天然维生素片进行还原型L-抗坏血酸,D-异抗坏血酸和抗坏血酸总量的测试,测定结果与样品标签值进行对比(表3,图3)。结果表明,四种食品标签上的维生素C含量与还原型L-抗坏血酸的含量更接近。表3还原型L-抗坏血酸,D-异抗坏血酸和抗坏血酸总量测定结果(mg/100 g)还原型L-抗坏血酸还原型D-异抗坏血酸抗坏血酸总量标签值配方奶粉74 ND 81 72粗麦奶糊粉39 ND 49 42水果酸奶糊35 ND 41 30维生素片15300 ND/15000注:“ND”代表“未检出”。图3乳粉中还原型L-抗坏血酸和L-抗坏血酸总量的图谱3结论本文建立了食品中L-抗坏血酸、D-抗坏血酸及抗坏血酸总量的高效液相色谱(HPLC)检测技术,具有简便、快速、灵敏度高的优点,适用于乳粉、谷物、水果、蔬菜及其制品类、肉类和保健食品等多种基质,固体样品的定量限为3.125 mg/100 g;液体样品的定量限为0.625 mg/100 g,能够满足我国及不同国家的法规要求。HPLC检测食品中L-抗坏血酸、D-异抗坏血酸及抗坏血酸总量@张秀芹$上海出入境检验检疫局!上海200135 @王敏$上海出入境检验检疫局!上海200135 @顾莹$上海出入境检验检疫局!上海200135 @周瑶$上海出入境检验检疫局!上海200135 @曲栗$上海出入境检验检疫局!上海200135 @陈迪$上海出入境检验检疫局!上海200135 @韩丽$上海出入境检验检疫局!上海200135 @倪昕路$上海出入境检验检疫局!上海200135 @朱坚$上海出入境检验检疫局!上海200135目的建立食品中L-抗坏血酸、D-异抗坏血酸及抗坏血酸总量的高效液相色谱法。方法试样经偏磷酸溶液超声提取后,液相色谱法直接测定还原型L-抗坏血酸和D-异抗坏血酸;加入L-半胱氨酸溶液,将脱氢抗坏血酸还原为还原型抗坏血酸后测定L-抗坏血酸总量。流动相为磷酸二氢钾-十六烷基三甲基溴化铵-甲醇(pH2.5~2.8);检测波长245 nm,外标法定量。结果 L-抗坏血酸和D-抗坏血酸在0.5μg/ml~50μg/ml范围内线性关系良好;平均添加回收率为84.4%~110.8%,RSD<7.00%(n=6);固体样品的定量限为3.125 mg/100 g,液体样品的定量限为0.625 mg/100 g。结论该方法简便、快速、准确,能够检测食品中L-抗坏血酸、D-异抗坏血酸及L-抗坏血酸总量。高效液相色谱(HPLC);;L-抗坏血酸;;D-异抗坏血酸;;抗坏血酸总量
