质谱沙龙第三十一期活动报道

2011-5-30 17:36 来源: 分析测试百科
收藏到BLOG

  2011年5月29日,第三十一期质谱沙龙活动在第二炮兵总医院药学部成功举行。来自第二炮兵总医院、北京大学医学部、北京师范大学、北京艾米诺医学研究有限公司等近二十余位专家、学者、技术工程师等参加了本次沙龙活动,共同探讨了质谱技术在生物医药方面的前沿应用。

质谱沙龙活动现场

氨基葡萄糖检测方法小结及有关问题讨论

  二炮总医院李鹏飞老师为大家带来了题为《氨基葡萄糖检测方法小结及有关问题讨论》的报告,简单介绍了氨基葡萄糖及其在人体中的作用,在总结5篇参考文献后,李老师给出了自己的分析检测方法,并探讨了在分析实验中遇到的各种问题及电喷雾离子化的影响因素。

二炮总医院 李鹏飞 老师

  氨基葡萄糖是存在于基体内尤其是关节软骨中的氨基单糖,是人体关节合成蛋白聚糖所必须的重要成分。基体吸收氨基葡萄糖后,进入关节组织包括关节软骨,随后经软骨细胞作用生成葡萄糖胺聚糖链的组分并刺激生理性蛋白多糖的合成。本品有直接抗炎作用,可缓解关节的疼痛症状,改善关节功能,并可组织骨关节炎病程的进展。临床适应症为原发性或继发性骨关节炎。

  文献总结

  李老师对5篇使用液质做的参考文献加以比较,具体情况见下表。

文献1 文献2 文献3 文献4 文献5
色谱柱 -CN -CN -CN -NH2 -NH2
前处理方法 沉淀-吹干-复溶 沉淀-吹干-复溶 沉淀-吹干-复溶 沉淀-过滤膜 沉淀
流动相 乙腈-2mM乙酸铵 乙腈-2mM乙酸铵 乙腈-2mM乙酸铵 乙腈-水 乙腈-少量醋酸
内标及保留时间 米格列醇 米格列醇 2.8/2.8 valibose 法莫替丁6.84/4.07 5.85(干扰) 罗沙替丁 6.6/3.6
定量离子对 180/72 180/72 180/72 180/162

  下面,李老师详细介绍了文献中样本前处理。取100mL血样,加入50µL内标、50µL甲醇和200µL乙腈,涡流1min,11000rpm沉淀5min,除去蛋白,然后取出200µL上清液转移至玻璃试管,在40℃下用氮气吹干,用50:50:2.5的200µL乙腈/水/乙酸复溶,最后取20µL进LC-MS/MS分析。按照次方法,李老师推测回收率至多是50%。

  接下来,李老师又讲解了基质效应、质谱条件和色谱条件,及其内标的选择。该内源性物质对离子化产生的抑制或增强作用比较大。由于它是高极性、碱性化合物,所以质谱条件选择ESI/[M+H]+正离子模式。氨基葡萄糖是高极性化合物,故很难用有机溶剂把它从血浆中萃取出来,蛋白沉淀是血浆制备的唯一方法,应用LC/ESI-MS/MS时可能会导致离子抑制。因此,血浆中氨基葡萄糖的准确定量需要合适的色谱柱和流动相。文献中是使用氨基柱和氰基柱,李老师在探索能否使用C8和C18柱子,而且对其进行衍生化。流动相最终确定为:乙腈/水/乙酸(50:50:2.5),保留时间为3.7min,色谱峰窄,分析时间为4.2min/样本。选择合适的内标对LC/MS/MS是较为重要的,稳定同位素标记的类似物作内标是被高度推荐的,因为基质效应不会影响被测物和内标离子化的相对效率,在该文献的实验中,Valibose在结构上类似氨基葡萄糖,被采用作为内标,和被测物几乎有一致的保留时间。

  李老师的方法

  李老师在参阅一些文献后,总结出了自己的分析方法。向1.5mL EP管中加入血浆样本150µL,加入内标沉淀剂150µL,涡流30s,13200r/min离心5min。将上清液移至2.0mLEP管中,加入1mL二氯甲烷,涡流30s,震荡10min,(6次/min),13200r/min离心5min,取150mL上清液进行LC-MS/MS分析,进样量15µL。

  色谱柱是Agilent TC-18柱,5mm粒径,150×4.6mm I.D.;流动相使用乙腈-0.01%氨水溶液梯度洗脱;流速控制在1.0mL/min,柱温20℃,进样量15µL;内标采用1.0µg/mL氨苄西林(5%磺基水杨酸水溶液)。李老师根据该方法和条件,对空白血、空白溶剂、空白血和标准化合物、实际样品等四种情况进行了分析。

  问题与讨论

  在氨基葡萄糖分析检测过程中,李老师遇到了一系列问题,并给出了他的思考看法和解决方案。1)氨基葡萄糖在体内存在,为什么空白血浆中检测不到?这是个有争议的问题,有的文献说有这种内源性物质,而有的说没有;在色谱图中有的可以看到,而有些看不到。2)样本前处理过程中,200µL上清液吹干后200µL复溶,有什么意义?200µL复溶能消除溶剂效应。3)内标选择原则?选择跟氨基葡萄糖性质相近的内标物质很困难,同位素内标是不行的,李老师尝试了氨苄西林、氯唑西林等多种物质。4)标准曲线范围的确定?达峰浓度的一倍以上作为高线,达峰浓度的1/5~1/20选择一点作为低线比较合适。5)离子抑制问题?前沿峰?死时间?选用C18柱检验这些参数。前沿峰是离子抑制最严重的问题,想办法怎样将前沿峰、死时间分开,对氨基葡萄糖抑制怎样排除掉。6)色谱柱分类?选用C18柱做。7)离子化方式?离子化是ESI源。

  电喷雾离子化的影响因素

  电喷雾离子化-质谱法(ESI-MS)作为一种软电离质谱技术,具有专业性强、灵敏度高等特点;液相色谱-电喷雾离子化-质谱法(LC-ESI-MS)作为分离和分析相结合的技术,特别适合分析极强性、难挥发或热不稳定的化合物,目前已成为分析复杂生物体系中痕量生物活性物质的强有力手段。电喷雾离子化过程有EI和TIS两种方式,EI是从进样口进来的样品液体被雾化气吹成雾滴,加上喷嘴上的高压电使雾滴带电,带电雾滴法去溶剂后生成样品离子;TIS工作原理同EI,不同的是TIS有辅助加热器(GS2),可加大去溶剂的速度,可用于比较大的液体流量。

  质谱离子检测器收集到分析物离子的数量多则响应值高,反之则低。ESI中决定响应值的因素由分析物的性质和仪器因素组成,分析物的带电能力是关键因素,仪器因素主要影响了分析方法的重现性。研究显示仪器因素对不同分析物的影响不同,仪器参数不仅对响应值有影响,LC-ESI-MS的喷雾电压、毛细管电压、毛细管温度和透镜电压等参数之间也有相互影响。影响分析物离子数量的因素还有溶剂的性质、组成和干扰物质的影响,添加剂、离子对试剂的影响,基质效应的影响,以及溶液的流速。

  最后,李老师总结说,ESI过程复杂,很多因素影响分析物最终的响应值。随着对其喷雾和电离过程研究的细化和深入,其影响因素将不断得到更全面、准确的认识。当各种因素影响LC-ESI-MS响应值的机制得到清晰阐述后,就可在体内药物分析过程中充分利用其特性,降低机制效应,排除干扰,获得更高的分析灵敏度和更好的分析方法重现性。

 

LC-MS分析方法在放射性药物研究中的应用

  北京师范大学化学学院的乔晋萍老师作了题为《LC-MS分析方法在放射性药物研究中的应用》的报告,介绍了LC-MS对放射性药物的分析及其在小鼠实验方面的应用。

北京师范大学化学学院 乔晋萍 老师

  放射性药物(radiopharmaceuticals)就是在药物结构中引入放射性核素,根据核素放射不同种类的射线而达到对疾病的治疗和诊断目的。作为一种非侵入性的诊断显像剂,放射性药物可以提供病变组织或器官的功能和结构信息,是核医学发展的基础和支柱。根据放射性核素发出的射线不同,放射性药物分为单光子放射性药物(SPECT药物)和正电子放射性药物(PET药物)。常见SPECT药物的标记核素是Tc-99m、I-131、Ga-67、Tl-201;PET药物的标记核素有C-11、F-18、O-15、N-13。乔老师所在实验室目前使用Tc-99m和I-131。

  LC-MS方法引入到放射性药物研究中,主要进行药物的质量控制和药物的代谢研究。临床使用SPECT药物时都是在核药房标记后,直接用于患者,因此放射性药物质量控制尤为重要,乔老师所在实验室就承担了此项的工作任务。乔老师通过UPLC-MS方法研究溶液中双半胱乙酯(ECD)的氧化动力学和经典恒温法研究双半胱氨酸(EC)稳定性和保质期两个实例详细讲解了使用LC-MS方法研究SPECT药物的一些研究进展。SPECT药物因为仪器检测分辨率低,在临床诊断疾病效果不明显,所以目前PET显像是核医学研究的主流。

  PET药物在标记过程会使用有毒催化剂和有害化学溶剂,且标记过程中会产生多种反应副产物,因此,临床使用前必须进行化学杂质检测。美国对此已经开始比较系统的研究,而我国2005版中国药典尚未收录正电子药物。乔老师指出一个成功的PET药物,必须具备高靶向分布、高亲和力、代谢稳定性好、药代动力学性质优良等性质。根据放射性药物的特点,乔老师建立了一个Radio-LC-MS的方法,把放射性的检测器和液质仪器联接起来,根据不同测试需要可以采用串联模式或并联模式。随后乔老师以帕金森疾病诊断的显像剂F-18标记的AV133为例讲述了Radio-LC-MS方法取得的实验结果。不断试验过程中,乔老师发现实验对小鼠的使用量很大,而且小鼠个体之间差异很大,这就造成试验数据的可靠性减低,为此乔老师引入了微透析的技术,得到的实验结果表明该技术的引入对实验帮助很大。但由于微透析和放射性检测仍存在一些差异,因此两者的匹配性研究还是今后需要解决的问题。

 

QTRAP实战指南之三——ER的应用

  AB SCIEX公司质谱部应用技术支持李立军经理作了题为《QTRAP实战指南之三----ER的应用》,介绍了高分辨ER扫描方式及其应用。

AB SCIEX公司质谱部应用技术支持李立军经理

  QTRAP仪器上有一个增强分辨率的扫描方式——ER扫描,这种扫描方式可以获得感兴趣离子的高分辨MS。第一个质量扫描四极杆(Q1)设定质量窗口为感兴趣离子的左右6~8amu。离子被贮存在离子肼中,在一个较窄的质量范围(~20amu)内以低扫描速度(250amu/sec)扫描输出,这种扫描方式可以得到~0.15amuFWHM峰宽。

  离子阱的ER不同于5600等TOF的高分辨率,QTRAP的ER得到的不是精确质量数,所以结果中并不能给出元素组成,主要用于观察电荷状态,确定带几个电荷或者用于区分两种混合物。对于IDA,可据此确定需要做EPI的母离子,相对准确度质量数。

  下面,李经理给大家讲解了ER在分析中的应用。1)某未知物,确定分子量。通过ER,看出245为双电荷峰,从而确定MW=488;另外,MS2(或EPI)也证明了245不是M+H。2)甘油三酯类扫描。用Q1扫描出现很多重合叠加的峰,分离很不明显,而ER能将每个峰都分离的很清晰。3)经过LC分离后的MS2,没有了425、369等碎片离子,进一步说明未分离时425、369等是由906.8(PPG类杂质)产生的。4)当定性分析初筛时或中性丢失时,因为得到的母离子往往分辨不足,容易产生误判,下一步EPI很可能会出错,这时也需要增加ER扫描,准确确定母离子。5)3200Q分析苯乙醇甘类代谢物。扫描速度选择250Da/s,李经理对PREC得到的质谱图和ER得到的质谱图进行了比较。6)对于生物大分子多肽的分析。最后,李经理简要总结了ER增强分辨率等优点。