Maldi-Tof-MS测试_检测_基质辅助质谱_服务

仪器型号： AB Sciex 5800 Maldi-Tof/Tof

原理

Maldi的原理是用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传递给样品，使样品电离的过程。

 

仪器技术参数

线性模式飞行距离：1.5米，反射模式飞行距离：3米。

质量准确度：MS模式 (线性) ≤200ppm (MW≥10,000)，MS模式(反射)：外标≤20ppm，MS/MS模式：≤0.2Da。

质量分辨率：MS模式 (反射) ≥20000，MS/MS模式：≥8000。

灵敏度：MS模式 (反射)：100amol Neurotensin，S/N≥10:1。

 

送样要求

可以溶解于常见的低沸点溶剂中

推荐常见的基质

分子量不大于4万

应用领域

    聚合物或者生物分子绝对分子量的分析测试

蛋白质鉴定

寡核苷酸

 

常见适用标准

专业、高效、精准、高性价比是剂拓公司的服务宗旨。

 

联系电话：021-20423181

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二、仪器的安装与调试

　　我们实验室是新建的，所以，仪器要求的电（380V交流电）、气、废气排放以及实验室温度、湿度等条件都已具备，无需太多改造。只是提前将UPS安装好。见：附件1 安 装 条 件 LTQ Orbitrap

　　整机固定装在一个大木制箱中，好像毛重近400kg。包装箱设计得很合理，前门打开后正好形成一个斜坡，仪器自带万向轮，顺着斜坡就滑出来了。不幸的是仪器比电梯门宽，经与工程师协商，决定先拆卸下MALDI源部分，验收大气压电离源（API）部分，以后再验收MALDI源。工程师费了很大力气卸下了MALDI源部分，仪器终于进了电梯，运进实验室。

　　仪器接好电、气（氮气、氦气）、循环冷却水机（仪器标准配置，要求温度控制在21℃，流量在2L/min左右）后，开始抽真空。LTQ Orbitrap是由线性离子阱和静电场轨道阱高分辨质谱组成。Orbitrap要求的真空较高（< 8e^-10 torr），与低分辨质谱相比抽真空多了一步，——当真空达到500e^-10 torr需对Orbitrap进行烘烤4 ~ 8小时，这样可以尽快将残存的微量水赶跑，达到高真空。通常开机、抽真空、烘烤全部完成是需要过夜的，第二天才可以校正仪器、检测。

仪器验收做了如下测试：

　　1.ESI源的测试

　  首先做的是ESI源，整个仪器调试、验收参数等都是在此模式下进行的。仪器带有校正液，用注射泵将校正液注入仪器。

      仪器的自动化程度很高，工程师建议在做Tune时选择自动模式。工程师还建议，第一次做Calibrate选择自动模式（约30 min），而日常校正选择半自动模式，通常LTQ一个季度对质量轴做一次校正，而Orbitrap则要每周对质量轴做校正。若只对质量轴校正很快，不到10 min。

      FT高分辨质谱测定化合物的精确质量数是重要工作，若日常检测时感觉质量出现偏差，应随时校正质量轴。经过一段时间的使用和考察，感觉仪器的质量稳定性还是不错的，如果实验室环境温湿度比较恒定的话，一周校正一次没有问题。

　　2. APCI源的测试。

     APCI源的更换很简单，只需将ESI源换下，换上APCI源即可。

　　3. ESI源Nano支架的测试。

      Nano支架的更换其实也不是很难，只是刚开始使用不太熟练。工程师建议初学者通过摄像镜头（CCD Camera）来调谐毛细管喷头与锥孔的位置和电喷雾状态。由于我们配置的 LC兼顾常规分析和蛋白分析，所以，液相色谱需要加装分流装置才能适合做蛋白分析。

      经过几天的实践基本掌握了纳喷操作。只是毛细管喷针比较容易损坏，而且也比较贵。以后买仪器时可以让公司多给配几盒毛细管喷针。

　　4.MALDI源的测试。

      MALDI源的更换比较复杂，与原来设想的，以及其它一些公司设计的差距较大。由于开始为了上楼将MALDI拆下时光路动了，因而再恢复、测试费了很大力气。简而言之，最终还是得到了比较好的测试结果。

      由于更换MALDI源与上述3个源（ESI/APCI/Nano）之间更换相比麻烦得多，而且还需要破真空，因此不适宜频繁更换。建议买仪器时要考虑周全，同时兼顾有些困难。

三、初步应用

1. 残留兽药的检测与确证

　　经初步实验感觉，LTQ Orbitrap的绝对检测灵敏度与三重四极杆质谱的MRM检测方式相比要差几倍，但与Q-TOF相比还是要高些。为了能够用于残留兽药的检测与确证，我们尝试前处理方式做些微调，最简单的办法就是加大取样量。实验证明，由于LTQ Orbitrap的高分辨性能可以很好地排除基质的干扰，所以，即便是加大取样量5 ~ 10倍，用精确质量数提取离子后本底依然很干净，且定量重现性也比较好。当然，加大取样量不可能是无限的，而且对于不同的检测化合物由于所选择的提取液不同，样品/溶剂的比也不同，导致最终的检出限也不同。这方面今后还有许多工作要做。

图1 香肠中50ng/g磺胺氯哒嗪，m/z 284.5- 285.5提取离子质量色谱图（登录状态下点击图，可看到更大的图例）

图2香肠2g样品中50ng/g磺胺氯哒嗪，m/z 285.02提取离子质量色谱图（登录状态下点击图，可看到更大的图例）

图3香肠10g样品中50ng/g磺胺氯哒嗪，m/z 285.02提取离子质量色谱图（登录状态下点击图，可看到更大的图例）

2. 代谢物的检测与确证

　　LTQ Orbitrap做药物代谢及代谢组学已有很多文献介绍。但对残留兽药及代谢物的检测与确证还未见报道。我们也做了初步实验。利用LTQ Orbitrap的高分辨、精确质量数的功能，可以在没有相对应的标准品的情况下找到并确定主要代谢物。这个工作要比目标物检测难度大，这不仅需要有质谱知识，还要有药物代谢知识。经初步实验感觉仪器的质量精度没有问题，可以满足我们目前工作的要求。若要检测残留兽药及代谢物，实验中遇到的问题可能还是灵敏度。如何提高灵敏度看来是今后用好这台仪器的关键之所在。

3. 蛋白质的检测

　　应用LTQ Orbitrap做蛋白质及蛋白组学的文献报道已有很多。我们一直以来是做农药、兽药、添加剂、化学有害物质等小分子化合物，做大分子对于我们来说是一个全新的领域。样品处理、检测、搜库、比对与过去小分子的方法都有较大不同。不过通过这次初步的实验，从概念上对蛋白质分析有了些认识，对整个方法过程也有了了解。经初步地重现文献方法，结果还是比较满意的。这也增强了我们下一步做好相关研究工作的信心。

　　总之，LTQ Orbitrap是一台很不错的仪器，利用它的高分辨和高质量精度功能，可以做一些以前做不好或者根本做不到的工作。它将增强我们实验室的检测能力。

【原创】LTQ Orbitrap XL购置及验收点滴（上）

　　一、选择这套仪器的背景与思考

　　2005年，那时候Finnigan公司虽已被Thermo收购，但质谱工作者还习惯叫Finnigan公司。应Finnigan公司北京办事处的邀请，参加了公司在华（北京）的新仪器LTQ Orbitrap发布会。

      那时虽然我做色谱-质谱的分析工作已有10年了，但是，一直用的是低分辨质谱。实验室首先配置的一台气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）是四极杆质谱，第二台液相色谱-串联质谱联用仪（LC-MS-MS）是三重四极杆质谱。

      虽然质谱的定性能力与传统的GC、LC的常用检测器（如FID、ECD、FPD、NPD、UV/VIS、FLD等）相比已经强很多了，然而在实际工作中有时还是会对检测结果产生疑惑，心里没底。例如：进口肠衣、牛筋（进口国禁用氯霉素已多年了），以及进口来料加工的深海鱿鱼、北极虾验出氯霉素等，理论上都是不会有的。常常在想还有什么检测技术能对这小部分结果给出更确切的结论呢？

      所以，一直关注高分辨质谱和多级质谱（离子阱质谱）的进展。离子阱质谱是从结构的多级碎片进行确证，但做多级灵敏度是个问题。高分辨质谱则是靠精确质量数确证，简单和直接，因而更值得关注。

      高分辨质谱与GC联用的有磁质谱、飞行时间质谱（TOF）等。磁质谱分辨率高、灵敏度也高，主要是用于二噁英、多氯联苯等项目的分析，但较高的仪器购置费用，使一般实验室很难配置。GC-TOF主要用于天然植物成分的分析，由于灵敏度的问题用于残留物分析的还不多。与LC联用的有TOF、傅立叶变换离子回旋共振质谱（FT ICR MS）等。LC-TOF主要用于蛋白质分析。现在液相色谱-四极杆-飞行时间质谱（LC-Q-TOF）也有用于残留分析的，但我们曾做过实验，其灵敏度无法满足欧盟对禁用残留兽药规定的检出限。对于残留分析，仪器的检测灵敏度是最重要的，仪器都检测不到，分辨率再高、质量精度再高也没用。FT ICR MS分辨率和质量精度都很高，相对TOF检测灵敏度也高些。但是该仪器不仅售价高，而且日常使用和维护费用也较高，对于我们这种非基础研究机构来说不是特别适用，领导很难同意购买。

      因此，对于这一新产品发布我还是抱有较高期待的。会上对LTQ Orbitrap仪器性能的介绍还是颇有新意，分辨率和质量精度虽然不及FT ICR MS，但比TOF高。最主要的是仪器的使用维护费很低。当今质谱分析最热的两个领域是蛋白质和药物代谢物分析，LTQ Orbitrap的应用也主要介绍在这两个方面的分析实例。残留分析在分析领域只是很小的一个方面，最初的应用是不会关注在这个领域的。既然LTQ Orbitrap有比较好的性能，价格当时是高些，但并不妨碍先对仪器性能和应用进行跟踪。

      随后的几年，公司多次在国内技术宣传活动和技术学术年会的论坛上介绍了应用LTQ Orbitrap做药物代谢及代谢组学、天然药用植物成分分析的实例，其中也提到了对于一些微量物质的定性分析。

      经与公司技术人员多次反复交流，特别是公司派专人来我实验室对仪器的性能及应用做更详细的讲解、答疑，虽然感觉检测灵敏度还达不到对非常痕量的残留物分析要求，但感觉好像比TOF要好，应该能满足大部分分析需求，而且仪器的独特功能可以做一些本领域创新工作。从实验室的发展和整体仪器配置考虑，开始奢望若有机会拟购置该仪器。但仪器报价还是比较高的，是本单位当时购买的仪器价格中从未有过的，单位领导是否同意购买心里没底。

      人若想做事先要有想法，并做好相关的准备工作，这样机会来了才能抓住。

      从2005年开始，国家食品安全出了几件事，国家对食品安全加大了投入，相关单位都分得了数额不等的仪器设备购置款。不久科技处领导到各检测中心调研，希望能做一些在系统内比较独特的研究工作，当然也需要与之相配套的仪器设备。于是我就提出了一些想法，以及实现这些工作所需仪器——LTQ Orbitrap。领导听后不但没有质疑，反而说价格还可以接受，他想着这件事。

      半年后开始申报仪器计划，就将LTQ Orbitrap列为中心优先购买仪器，并报上级部门审批。经过努力上级部门也最终批准了。我们的实验室终于有了高分辨质谱，整体仪器配置更合理、更完善了。



未完待续......

【原创】LTQ Orbitrap XL购置及验收点滴（下）

　　下面分别介绍一下不同类型MS组合的特性。各种类型MS的原理不做详细介绍，可参考一些文献和网上的文章。

三重四极质谱仪

　　LC-MS配置API后虽与早期仪器相比大大提高了S/N，但检测灵敏度也就与LC的紫外检测器(UV)相当。这个灵敏度用于食品中残留物检测显然还不太够。直到二十世纪九十年代末，液相色谱-三重四极质谱(QqQ)联用仪商品仪器逐渐成熟了，检测灵敏度不断提高，价格不断降低，开始为食品检测实验室越来越普遍的采用。QqQ MS的工作原理见图5。

图5 三重四极分析器工作原理

　　由图5可看到，QqQ MS的第一级(Q1)选择出要检测的目标化合物，滤去其它干扰物，所以，大大降低了本底噪音，提高了信/噪比。在第二级(q2)，碰撞气(通常是稳定性气体，如：氮气、氩气等)将目标物打碎，施加的碰撞气能量不同，碎裂产生的离子及离子丰度就不同。碎裂的离子在第三级(Q3)被依次排列，然后送至检测器检测得到二级质谱图——化合物的特征质谱图。

　　应用QqQ MS进行残留物分析时，主要采用多反应离子监测模式(MRM)，其原理见图6。

图6 MRM监测模式

　　如果在Q3仅选择2个离子(根据欧盟2002/657/EC指令，对残留兽药检测通常是选择1个母离子，2个子离子)有点像GC-MS的SIM方式，这就是QqQ质谱特有MRM方式，见图6。这种检测方式的检测灵敏度目前是所有类型质谱中最高的。因而食品实验室做残留检测最常用的是QqQ MRM，也建议购置第一套LC-MS-MS时选择QqQ MS。

　　现在国外主要生产QqQ MS公司有AB Sciex、Thermo-Fisher、Waters、Agilent、岛津等，目前国内实验室全部配置的是这几家公司的仪器。各仪器公司的仪器成系列(从低性能到高性能)，这几家公司的仪器性能有些差异，因而价格也有些差异，从不到200万人民币，高到400多万人民币。性能指标可参考分析测试百科网提供的数据（http://www.antpedia.com/pcenter/cat-139/）。

离子阱质谱仪

　　IT-MS又分为三维离子阱质谱和线性离子阱质谱，见图7。IT-MS的最主要的特点是它可以做多级质谱(MSⁿ)，公司称可做到10级（找到合适的化合物）。通常说QqQ MS是空间串联的，而IT-MS是时间串联。

图7 离子阱质谱仪的分析器，左图为3维离子阱分析器，右图为线性离子阱分析器

　　IT-MS虽然也能做MS-MS，甚至MSⁿ，但其原理是将保留在阱内的被测物离子再进一步打碎，然后进行检测。因此，IT-MS不能像QqQ MS那样做MRM检测，检测灵敏度也就达不到MRM的量级；另外，IT-MS虽然可以做多级，但应用上，打碎的级数越多灵敏度也就越差，药物残留分析本来对灵敏度要求就高，多级后就更满足不了灵敏度要求（当然，对于做研发或主成份分析的部门多级是有用的）。所以，用IT-MS做禁用兽药的残留分析比较少。

　　线性IT-MS的灵敏度较传统IT-MS的灵敏度有较大的提高，这主要是线性IT-MS储存离子区域是一条线，而传统IT-MS储存离子区域则是一个点。现在Thermo-Fisher公司提供的技术指标，线性IT-MS为 250fg 利血平 S/N≥100，传统IT-MS为 2pg 利血平S/N≥25。且线性离子阱质谱较传统离子阱质谱而言改善了1/3效应问题。由于QqQ MS已成为残留分析的主流技术，所以即便是线性离子阱的检测灵敏度也能适应残留分析了，人们还没有过多地关注它。但是当实验室已有了QqQ MS，再准备购置第二套LC-MS时，还是可以考虑的。

　　三维离子阱质谱仪的价格相对较低，与QqQ MS的低端产品相当。线性离子阱的价格高些，与QqQ MS中高端产品相当。

四极-线性离子阱质谱仪

　　四极-线性离子阱质谱仪(QTRAP)为AB Sciex的推出的一款组合质谱仪。该类型仪器的结构与传统的QqQ MS基本一样，见图8。

图8 四极杆-线性离子阱质谱仪结构图

　　QTRAP的特点是在Q3两端加上一组电场，使Q3具有线性离子阱质谱功能。所以，QTRAP它同时拥有串接质谱和离子阱质谱的功能，如图9所示。

图9 离子阱质谱、串联四极质谱及四极杆-线性离子阱质谱仪检测功能

　　QTRAP的独特功能是在TRAP做增强离子扫描(EPI)，利用这一模式可以得到高灵敏度的全扫描图，其灵敏度比普通QqQ的MRM方式得到的稍低，却可以得到被测物更详细的分子信息，基本避免假阳性。所以通常该仪器可以像QqQ MS一样做MRM检测，得到较高的灵敏度，而当对结构有疑问时可以再用EPI模式检测一下。另外还可以做MS³，对化合物的结构进行解析。这一型号质谱仪较同型号QqQ MS贵些(如API 4000QTRP比API 4000要贵)。所以，对于残留分析实验室如果经费允许也可以考虑该类型的仪器。这样多花一点钱，多买了两种功能，还是比较划算的。

线性离子阱-静电场轨道阱质谱仪

　　线性离子阱-静电场轨道阱质谱仪(LTQ Orbitrap)为Thermo-Fisher公司推出的一款组合质谱仪。从名称就可以看出该仪器是由线性离子阱质谱与静电场轨道阱质谱仪组合而成。其结构如图10。

图10 线性离子阱-静电场轨道阱质谱仪结构图

　　线性离子阱质谱的功能特点前面已经介绍过了。这里主要介绍一下Orbitrap。Orbitrap的核心部件见图11，原理图见图12。

图11 Orbitrap分析器核心部件

图12 检测工作原理及傅立叶变换计算公式

　　由于Orbitrap也是利用傅立叶变换技术将离子的振幅转换成m/z，因此，现在也将该仪器划在傅立叶质谱仪类。Orbitrap的特点是具有高分辨和精确质量数功能。公司标称分辨率达100,000，外标法质量精度小于3ppm。

　　公司提供的Orbitrap仪器验收灵敏度是：当注射泵以5µL/min速度为注射仪器测试液时，咖啡因(含量为20µg/mL) m/z 195.0876 S/N > 40。这个指标不够直观。我们尝试用残留分析者更习惯的做法，用绝对检出量考核了一下仪器整机的灵敏度，其结果为2pg的磺胺间二甲氧嘧啶，提取m/z 279.0904质量色谱图后得到 S/N = 42(RMS)。详细的测试方法请见我的上一篇博文《LC-LTQ Orbitrap XL整机灵敏度的测试》。但当采用精确质量离子提取时，由于高选择性较好的滤去了基质干扰，所以可以采用加大取样量方法来提高方法的检测灵敏度。实验证明，加大取样量5-10倍，用精确质量数提取离子后本底依然很干净，且定量重现性也比较好。仪器的一些特性及测试请见我已发表博文《LTQ Orbitrap XL购置与验收点滴》（上半部分  下半部分） 。因此，最终的检测灵敏度与QqQ比相差应该在一个数量级以内，1ppb以上检测限的项目肯定可以满足。前两月我们试着检测了动物源食品中残留的氯霉素，做到了0.1 µg/kg。待将方法进一步完善后放到网上与大家交流。

　　目前LTQ Orbitrap XL价格还是比较高的，大约为2台QqQ的价格。现在Orbitrap也推出了一款低档机型，据说只是分辨率降到了60,000，其它指标都一样，价格能降下来不少，但价格依然比Q TOF高。所以，一般的实验室还暂时不能配置。若实验室已购置了QqQ，且已基本上能满足日常检测的需求，当经费允许的情况下还是可以考虑。仪器具有的高分辨和精确质量数功能可以对QqQ的阳性结果做进一步确证，使出具的结果更可靠。

四极杆-飞行时间质谱仪

　　四极杆-飞行时间质谱(Q TOF MS)组合质谱结构见图13。图中所示MS1为四极杆质谱，MS2为飞行时间质谱。TOF常见漂移管有两种，图13上图为V型，图13下图为W型。W型与V型相比离子飞行的路程长，因而分辨率高些，而灵敏度差些。

图13 四极杆-飞行时间质谱仪结构图

上图为V型漂移管，下图为W型漂移管

　　Q TOF商品化已有约20年了，经过不断的改进性能也在不断提高。根据TOF的分析原理，通常分子量越大分辨率越高，因此，TOF更适合分析蛋白等大分子化合物。但是，TOF是一款具有高分辨，且相对价格较低的MS，各公司为了满足小分子分析的需要对仪器也进行了不断改进、完善。传统Q TOF的检测灵敏度适应不了残留兽药的检测，因而过去一直没能进入残留实验室。现在有公司最新推出的Q TOF标称检出限1pg利血平能到100:1。实际应用于农药残留检测的文献有一些，但用于兽药残留检测的还很少。

　　现在国外主要生产Q TOF MS公司有AB Sciex、Waters、Agilent等，国内实验室配置的也全部是这几家公司的仪器。各仪器公司的仪器成系列，这几家公司的仪器性能有些差异，因而价格也有些差异，从不到200万人民币，高到近500万人民币。性能指标可参考分析测试百科网提供的数据(http://www.antpedia.com/instrument/cat-139/)。

离子阱-飞行时间质谱仪

　　离子阱-飞行时间质谱联用仪(IT-TOF)为岛津公司推出的一款组合质谱仪，其结构见图14。

图14 离子阱-飞行时间质谱联用仪结构图

　　该仪器前端为ITMS，因此具有ITMS的功能和性能——MSⁿ、较高的全扫描灵敏度，后部为TOFMS，因此具有TOFMS的性能——高分辨、精确质量数。公司介绍IT-TOFMS利用ITMS的离子富集功能，使其仪器具有较高的灵敏度，检出限可达10pg/mL。这个检出限基本上可以满足农药残留检测。此外，据使用过该仪器的老师介绍，该仪器的正负电极切换速度目前是最快的，因而可用于多种农残的筛查。但对残留兽药的检测目前报导较少。

　　以上是一些粗浅的认识，仅供参考。

　　总之，近年随着我国国力的增强和质谱仪生产厂家之间竞争的加剧使LC-MS的价格不断降低，配置LC-MS的实验室越来越多，一个实验室配置多台、多类型也不足为奇。因此，现在选型调研比以前容易的多了。只要认真做好前期工作，一定可以选择款最适合自己实验室的仪器。

全信息串联质谱(MS^E)能提供什么样的信息?

1. 未知分析物的定性与定量在同一次分析中完成。

2. 同时获得母离子及碎片离子的高分辨、高质量精确数据。

3. MS^E普遍适用于各种未知物分析，而且方法设置非常简便。

4. 充分发挥UPLC-MS液质联用的卓越性能。

什么是全信息串联质谱(MS^E)?

1. MS^E是在一次液质分析中同时获得高精确的母离子及碎片离子信息的串联质谱方法。

2. MS^E由“无碰撞能”与“高碰撞能”两种扫描交替构成，分别记录母离子及碎片信息。

3. MS^E通过母离子与其碎片离子具有相同色谱行为的特性进行母-子离子的关联归属。

全信息串联质谱(MS^E)有哪些特点?

1. 全面：所有的离子信息都被记录，定量、定性更加准确。

2. 精准：全部母离子与碎片离子信息都是高精度、高分辨的质谱数据。

3. 简单：方法设置仅需：质量范围、采集时间、碰撞能量三个参数。

4. 灵活：碰撞能量为线性升高的方式，因此不同分析物可在其最佳碰撞能下实现碎裂。

与常规的DDA串联质谱法比较，MS^E的优点是什么?

数据依赖型串联质谱法(D DA，D a t a D e p en d entAcquisition)是通过选择特定母离子进入碰撞池，从而采集相应的碎片离子。而MS^E并不选择特定母离子进行单独碎裂，而是同时采集了所有母离子的碎片离子。这样MS^E就避免了由于DDA采集速率的限制而造成的信息采集不全的问题。此外，MS^E这种匀速高频的数据采集模式，对每个离子都可以得到其“完美”色谱图，而用以精准定量。相较之下，DDA由于采集的偶然性问题，其色谱峰往往存在缺陷，而影响定量准确度。

　　3 在线净化-色谱/质谱联用技术

　　多维色谱技术除包括多维气相、多维液相之外，目前发展的在线净化与色谱/质谱的联用技术也属于多维色谱范畴。离线的前处理方式耗时长、耗资大，并且重现性差，操作过程中还可能会带来二次污染，因此需要开发在线净化技术。目前食品检测中常用的在线净化技术主要包括在线凝胶色谱和在线固相萃取。

　　3.1 凝胶色谱-气相色谱/质谱(GPC-GC/MS)

　　凝胶色谱(gel permeation chromatography，GPC)对于消除大分子物质的干扰具有较好的效果，已成为一种常用的前处理净化方法，用于除去脂类、蛋白质和色素等杂质，还可以提高分析方法的精密度和精确度。GPC可以与GC或LC联机使用，构成二维色谱。GPC与GC联用实际上属于LC-GC联用，LC-GC联用的难点是如何将大量的溶剂快速挥发，传统GPC的流速是 5 mL/min，要将其与GC联用难度较大，目前的联用技术是将GPC柱微量化，流速降为0.2 mL/min，配合GC的PTV汽化室，以及独特的预柱连接方式，较好地解决了二者联用的问题，见图7。

图7 GPC-GC/MS示意图

Figure 7 Schematic diagram of online GPC-GC/MS

　　根据GPC理论，分子量较大的脂肪和色素先从色谱柱中流出，通过六通阀位置的设定将这些基质干扰物排出系统，之后将所要检测的小分子量的农药成分导入试样捕集环路后再送入GC/MS进行分离检测。GPC-GC/MS联用技术是一项方便、快捷、准确的分析方法。目前国内外很多学者将该项技术应用到食品中残留农药检测领域。如Hashi等使用GPC-GC/MS联用技术测定包括有机氯、有机磷、有机氮、氨基甲酸盐、硫代氨基甲酸盐等97种农药残留，大多数农药的回收率在70~120%，相对标准偏差小于10%；杨惠琴等采用GPC-GC/MS测定植物性产品中75种农药残留，检出限在0.01-0.05 mg/kg之间，满足植物性食品中多种农药残留的筛选，具有灵敏、快速、重现性好的特点。张帆等利用该技术测定苹果中的2 ,4-二氯苯氧乙酸残留检测限为5μg/kg;康庆贺等采用该联用技术测定松子仁中的28种有机氯农药和拟除虫菊酯，检测限在2~50ppb，回收率在70%~120%之间。

　　在GPC-GC/MS的基础上我们实验室又组合了一套凝胶色谱-二维气相色谱-质谱联用技术(GPC-2DGC/MS)。这样组合主要用于动物源食品中农药残留的检测，该项技术较之GPC-GC/MS可以更有效的减少本底干扰。目前该项技术已经用于农药多残留分析，但是还未推广使用。

　　3.2 在线固相萃取-液相色谱-质谱联用技术

　　固相萃取(Solid Phase Extraction, SPE)技术是食品中残留物分析的重要前处理手段，可以对多种极性的物质进行净化、富集，因此SPE成为样品前处理过程中首选的方法，近90%残留兽药的检测项目都采用SPE净化。虽然SPE净化过程不是一个典型的液相色谱过程，但可以将其视为一个广义上的色谱过程。SPE柱典型净化操作步骤为：活化—平衡—上样—淋洗—洗脱。完成一个操作程序通常要20分钟以上，如遇到高脂肪、高蛋白样品有时花费的时间会增加数倍。若洗脱液中含水，吹干定容所花费的时间则以小时计。所以将SPE技术和色谱-质谱技术在线联用可以大大缩短前处理时间，并减少有机试剂的使用量。

　　SPE与LC-MS联用有两种模式。其一是全自动模拟SPE，一个样品用一个萃取小柱，机械手将SPE柱从SPE柱架上取下并放置于流路上，先进行SPE操作进行净化分离，然后经过阀切换再切换到LC流路中进行分析，由于采用高效SPE柱，因此洗脱样品全部进入LC分析柱。整个过程通常不超过10分钟，较离线方式效率提高了很多。该仪器国外多用于血药检测，现在国内医院也有使用。我们实验室首先将其引进用于动物源食品中残留兽药及食品中添加剂的检测，经试验已初步建立了一些方法，如：动物源食品中盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇的检测，检出限可以满足国际上最严的限量要求;奶及奶制品中的三聚氰胺检测也很方便、快捷。其它的检测方法还在试验中，待方法成熟后将与大家分享。通过实验，看到了该仪器用于食品残留物检测的广阔前景。有的仪器公司的自动SPE仪则是增加了可控六通阀和触发信号控制，可以直接与LC-MS连接联用，组成在线SPE-LC-MS。

　　另一种为在线净化-液相色谱-串联质谱仪。该技术主要特点：

　　(1)萃取柱是反复使用的，该萃取柱类似液相色谱柱，一次进样完成一次吸附-解析-平衡后再进行下一次进样操作；

　　(2)柱填料不是传统的填料。虽然就柱填料而言与传统的SPE一样，有C18、C8、MAX、MCX等，但其柱填料、柱规格和柱流量的特殊配合，使其既具有类似凝胶色谱的分离过程(按分子量大小分离)，又具有分配色谱的分离过程(按化合物与固定液之间的分配性能差别分离)；

　　(3)操作模式独特。由于柱径细，颗粒直径大，流速快，因此在柱里形成湍流，大分子化合物随流动的液体被排到废液瓶(这过程类似于凝胶色谱分离)，小分子化合物进入孔穴中，孔穴中的固定液选择性的吸附适合极性的化合物，而极性差异大的化合物随液体被排到废液瓶中(这个过程类似于SPE吸附-淋洗)，然后改变流动相和流向，将吸附在萃取柱上的化合物冲洗下来(这个过程类似于SPE的洗脱)，并送入LC流路(相当于LC进样)经LC分析柱对被测物进行分析。一个典型的样品处理过程为3~5分钟，与传统SPE操作过程“活化—平衡—上样—淋洗—洗脱—吹干—定容”相比仅是它的约1/8，而且还节约了试剂成本。

　　在线SPE-LC/MS已经广泛应用于食品多残留分析、蛋白质分析等领域，该技术的应用大大减少了前处理的时间，提高了工作效率。Liao等利用在线SPE-LC/MS测定脐血浆中的氯氰菊酯和毒死蜱农药残留，检测限可达到0.01~0.05 ppb，整个检测过程仅需要7 min。我们实验室利用在线SPE-LC/MS测定奶及奶制品中的三聚氰胺，药材中的真菌霉素和动物源性食品中的克伦特罗，在节省人力、简化前处理的步骤的同时方法满足国内外的限量要求。

　　另外，多维色谱-质谱除了检测食品中的有害残留物，还可用于食品、中药等商品指纹谱库的建立，对产品的等级分类、真伪鉴别、产地确定等可以提供技术支持。这是很大的一部分工作，但现在人们更关注食品卫生，所以，这项工作目前还没有太被重视。但我们实验室也开始尝试做一些相关的工作。

　　总之，多维色谱-质谱技术发展已日臻成熟，应用领域越来越广。虽然在食品中残留物分析领域的应用起步较晚，但也有相关工作者开始涉足。面对越来越多的食品安全问题，迫切需要建立起更高效、灵敏、准确、绿色的检测平台，而多维色谱-质谱联用技术的特性正好符合这个需求，因此必将得到快速发展。我们实验室这些年开始尝试多维色谱-质谱检测食品中的有害残留物，并取得了初步成果。接下来还会做更多的应用实验，包括食品中药的等级分类、真伪鉴别、产地确定等。希望有更多的同行关注这一领域，成果大家供享。

　　2 二维液相色谱-质谱

　　上个世纪末就提出了二维液相色谱的理论，二维液相色谱通常采用两种不同分离机理的柱子分析样品，即利用样品的不同特性把复杂混合物分成单一组分，这些特性包括分子尺寸、等电点、亲水性、电荷、特殊分子间作用力(亲和)等，在一维分离系统中不能完全分离的组分，可以在二维系统中得到更好的分离，因此分离能力、分辨率得到极大的提高。理论上二维液相系统中以正相色谱/反相色谱的组合模式分离效能最高，但困难也最大。首先是流动相兼容问题;其次是第一维色谱峰的展宽使得进入第二维的进样谱带宽度比第二维柱的塔板高度大2~3个数量级，又很难利用溶剂聚焦作用来压缩进样谱带，导致分离效率大大降低。到目前为止，主要采用3种方法来实现正相色谱/反相色谱的在线二维联用：

　　(1)在两维间采用溶剂转换接口，第一维流动相在接口处蒸发，第二维流动相将样品组分洗脱后转移到第二维进行分析。采用该种方法操作较为复杂，对仪器的控制严格，不易实现自动化；

　　(2)第一维采用含水流动相进行洗脱，从而解决了两维流动相不互溶问题。但这种洗脱方式增加了两维分离性能的相关性，极大的降低了二维系统的选择性；

　　(3)第一维采用微柱，而第二维采用常规柱进行二维联用，使第一维切割到第二维的样品体积大大降低，因为微量的不互溶流动相进入第二维对其柱效不会造成显著影响。近年开发出反相极性柱，较好的解决了正相流动相进入反相色谱柱的问题，使极性柱与非极性柱串联变得简单了。

　　根据第一维的馏分是否完全转移到第二维，二维液相色谱又分为切割式二维液相色谱，即传统二维液相色谱(LC+LC)停留二维液相色谱和全二维液相色谱(LC×LC)。

　　2.1 传统二维液相色谱(LC+LC)/MS

　　1978年Frei等采用SEC/RP二维分离系统分离植物萃取物，首先建立LC+LC的基本框架，而后LC+LC技术逐渐成熟。LC+LC的第一根色谱柱就相当于一个净化柱，与在线SPE柱不同的是，在线SPE柱一般是对一个或一组性质相近的化合物作为分析目标物进行净化，也就是被测物一次被洗脱后进入LC柱分析。而LC柱作为净化柱时，可以将被测物一组一组的送入LC柱进行分析，通过设定切割时间，将不同组分送入第二维色谱柱中进行分离分析，这样可以得到感兴趣组分更详细的信息。图5给出了LC+LC的流程简图，a表示一维分离，切割感兴趣组分;b表示二维分离由一维分离系统切割进入第二维分离系统的组分。

图5 LC+LC的流程简图

Figure 5 Schematic diagram of LC+LC

　　LC+LC技术已经广泛应用药物、食品分析。2011年Moretton等利用LC+LC检测焦糖色染料中的4-甲基咪唑残留，两维都采用反相柱，固定相选用C18硅胶柱(第一维)和多孔石墨柱(第二维)。与GC/MS(4-甲基咪唑浓度为25ppm时，RSD%=8.3%)方法相比，LC+LC检测限更低(4-甲基咪唑浓度为20ppm时，RSD%=4.3%)，并且仪器运行时间短。我们实验室利用二维液相色谱-组合质谱(2DLC-Q/TRAP)初步试验了动物源食品中3种不同化学结构14种残留兽药的检测，方法简单、快速、定性定量准确，为不同化学结构的多种残留兽药的同时快速、准确检测做了有益的尝试。现在在做更多化学结构、更多兽药的检测。

　　2.2 全二维液相色谱 (LC×LC)/MS

　　Bushey等改进了Frei的方法，使第一维洗脱产物全部转入第二维系统中，实现了真正意义上的LC×LC分离。LC×LC由采用两种不同分离机理色谱柱的一维分离系统通过一定的切换模式结合而成。根据不同的分离目的，尺寸排阻色谱(SEC)、离子交换色谱(IEC)、反相色谱(RP)、疏水作用色谱(HIC)和亲和色谱(AC)等都可以用于构建LC×LC系统。LC×LC克服了中心切割技术的弊端，使一维洗脱产物全部进入第二维模式中继续分离，同时也实现了在线分析，使分析时间缩短。因此更适合用于多种性质差异较大的化合物分析。以正相/反相全二维分离系统为例图6给出了LC×LC的工作示意图。当在位置1(Position 1)时，第一维洗脱物被储存在阀II的样品管1(Loop 1)中。而泵2推动流动相经样品管2(Loop 2)到反相柱，最终进入检测器。当处于位置2(Position 2)时，将阀II切换到B位，第一维洗脱出来的组分储存在Loop 2中，与此同时泵2推动流动相将Loop 1中储存的组分转移到反相柱内进行分离检测。如此反复操作，使第一维洗脱出来的组分交替储存在两个定量环中，并依次进入第二维进行反相色谱分离。实验证明第一维采用聚乙二醇-硅胶柱、第二维采用C18柱可以实现最大限度的正交分离。

图6 全二维液相色谱的流程示意图

Figure 6 Schematic diagram of comprehensive two dimensional LC

　　LC×LC已经发展成为一项成熟的技术应用于各个领域包括医药、植物提取物、成分分析等。

　　二维液相色谱-质谱在食品残留分析方面的研究报道并不多见，而随着食品残留检测项目的增多和低检出限的要求，二维液相色谱-串联质谱联用技术将会成为食品残留分析中重要的检测手段。

未完待续。。。

　　然界有许多非常复杂的体系，如：石油组成、植物精油组成、蛋白质组、代谢组等;复杂体系的分离分析是我们面临的挑战，即使采用分离效率很高的毛细管色谱柱等技术手段，仍无法将其中每一个成分都完全分离开。为解决这些问题，色谱工作者研究出了用多维色谱技术对复杂组分进行充分分离并分析的方法。多维色谱技术是二十世纪60年代研发出来的，90年代商品机问世。随着硬件、软件和计算机技术(全二维色谱的运算软件及数据处理对计算机有较高的要求)的发展，该技术和仪器逐渐完善和成熟，连接形式也多样化，多维色谱技术正成为分离和分析复杂样品的重要技术手段，应用领域也在不断扩大。多维色谱技术在食品领域检测中的应用实例也在不断增加。

　　多维色谱可以是同一种色谱分离技术的两种不同极性色谱柱的组合，如：气相色谱-气相色谱(GC-GC)，液相色谱-液相色谱(LC-LC)等; 也可以是不同色谱分离技术的组合，如：液相色谱-气相色谱(LC-GC)等。多维色谱分离具有三条基本原则：(1)所有样品组分的色谱分离要经过两种或两种以上的独立模式;(2)各组分间的分离效率不受后续分离的影响;(3)两维分离的色谱结果要得到保存。以二维色谱为例，根据第一维组分是否完全进入第二维进行分离，可以分为传统二维色谱技术和全二维色谱技术。

　　传统的二维色谱技术(Two- dimensional chromatography)是将不同极性的两根色谱柱通过一个接口组合起来，将在第一根色谱柱上分不开的组分送入第二根色谱柱进一步分离。这种联用技术通常用来提高对复杂样品中目标物的分离效率，习惯用C+C表示，其峰容量为n+n。全二维色谱技术(Comprehensive two-dimensional chromatography)是在传统二维色谱技术的基础上发展起来的新技术，具有峰容量大、分辨率高、族分离和瓦片效应等特点。全二维分离满足三个条件：(1)样品每一组分都得到不同模式的分离;(2)第一维所有样品组分都被转移到第二维及检测器中;(3)在一维中已得到的分辨率基本上维持不变。全二维色谱用C×C表示，其峰容量为n×n。可见，全二维色谱的峰容量比传统二维色谱的大很多，因而更适合用于全组分分析，或复杂基质中多组分分析。

　　用多维色谱技术，从复杂体系中分离出了更多物质，当然希望与之配合使用的检测器能告知检测到了什么物质。用普通的色谱检测器，如：氢火焰检测器 (FID)、电子俘获检测器(ECD)、氮磷检测器(NPD)、可见/紫外检测器(VIS/UV)、荧光检测器(FLU)等，无法满足这个要求。能与现代高效色谱技术相匹配，并能给出被测物分子信息的检测器首选质谱(MS)。质谱是目前能给出化合物分子信息的检测器中灵敏度最高、响应速度最快的。质谱检测器现已成为食品中残留物分析能同时准确定性和定量的最重要检测器。在国际上食品中残留物分析阳性结果的最终报告通常以质谱检测结果为准。因此，多维色谱- 质谱联用技术已成为当今分离和分析复杂样品最好的联用仪器，而且也是符合食品中残留物定性、定量检测法规的联用仪器。

　　食品也是一个复杂体系，特别是加工后的动物源食品，如罐头、香肠等，体系更为复杂。食品中残留物检测，要求从复杂体系中检测出可能存在的微量残留物，所以是一项难度较大，且耗时、繁琐的分析工作。在民生领域，食品安全问题近年已成为人们关注的焦点;在跨国贸易方面，食品安全问题还是一些发达国家贸易保护的技术措施。从而导致食品需要检测的残留项目越来越多，其中的卫生理化项目包括：农药残留、兽药残留、食品添加剂(包括非法添加物)、生物毒素和化学污染物等。如日本肯定列表要求检测的农药残留项目就有799项，兽药残留项目188项。而检出限则要求越来越低，如日本肯定列表规定肉及肉制品中盐酸克伦特罗(瘦肉精)的检出限为0.05 µg/kg。现在有一些快速检测方法，主要是一些生化法，如：酶联免疫法、放射免疫法、胶体金试纸条法等。这些方法的最大问题是无法准确的定性，不能依此结果出阳性检出报告。所以，食品中残留物检测常用的，并为官方认可的方法还是以仪器法为主，定性则多为色谱-质谱法。具体分析方法虽有差异，但为了满足残留物检出限和准确确证的要求，归纳其分析包括四步(详细内容可参见我的“ 食品中残留物分析”一文)：

　　提取——索氏提取，高速均质，震摇，浸泡，溶剂加速萃取，微波萃取等。

　　净化——液液分配，固相萃取(SPE)，凝胶渗透色谱(GPC)，免疫亲和柱，固相微萃取，液相色谱等。

　　浓缩——自然挥干，氮吹，旋转蒸发，K-D浓缩等。

　　检测——定量(色谱)，定性(质谱)等。

　　食品中残留物分析工作者在探索建立新检测方法时会关注以下几点：方法的检出限一定要满足法规规定的要求;方法要符合分析方法学的各项指标;方法尽可能的简便、快速，易推广使用，分析成本要尽可能的低，还有就是现在比较提倡的绿色环保(减少有机化学试剂的使用量)。在这四个步骤中净化、浓缩所用时间要占到整个分析过程60%以上。观察这四步可以发现，除第一步提取是用溶剂将样品(多数为固体)中的被测物转移到溶剂中，即：固-液体系外，随后的几步均为对液体混合体系操作，只是将被测物在不同的溶剂体系中转移。因此，可以想象将后三步操作组合起来实现仪器化、自动化相对要容易些。基于上述的思考，加上计算机硬、软件的发展以及综合采用各种先进的加工技术和特殊材料，近年国外各大仪器公司陆续推出多款商品化的多维色谱(包括一些在线净化-色谱)-质谱联用仪，残留分析工作者，包括我们实验室也开始尝试应用多维色谱-质谱联用技术检测食品中残留物。该技术基本上概括了现代残留分析发展的几个特点，为食品中残留物检测提供了一个新平台。多维色谱-质谱联用技术应用于食品中残留物检测有以下特点：更有效排除基质的干扰;更适用于多残留检测;更好的识别被测物;更高的分析灵敏度和效率。

　　现在商品化的多维色谱-质谱联用仪已有很多种，下面分别论述。

未完待续。。。