外泌体lncRNA测序

       Exosome作为活细胞分泌的含有RNA和蛋白质的微囊，大小为30-100nm，广泛分布于外周血、尿液、唾液、腹水、羊水等多种体液中。最新研究表明，体液中 exosomal RNA （特别是miRNA、piRNA和lncRNA等非编码RNA）在不同的疾病模型中存在明显的表达差异。同时，这些分子被exosomes的脂膜所包裹和保护，能保持其原有稳定性和生物学功能，有望成为液体活检的重要分子标志物。
       通过exosome lncRNA测序技术，可以开发针对复杂疾病的无创早期检测标志物；指导针对复杂疾病特别是肿瘤的个性化治疗；用于疾病的预后判断，特别是循环系统疾病和肿瘤。
       华银采用全球领先的exosome RNA富集和提取技术，并结合微量RNA建库和高通量测序技术，提供exosome lncRNA研究整体解决方案，为广大的生物医学研究者提供最高质量的技术服务。

1、实验方案

     测序策略：Illumina 平台  PE150
     数据量：12G clean data

2、技术优势

（1）更佳的提取⽅法：针对客⼾样本类型，提供不同的提取⽅法（超离法或试剂盒法等），提⾼外泌体质量；

（2）更优质的改良：在提取外泌体之前，免费给客⼾提供过膜处理的选择，可进⼀步增加样本纯度（仅限细胞上清和其他体液）；


（3）更全的鉴定实验：提供外泌体透射电镜观测、粒径分析、表⾯标志蛋⽩检测共三项鉴定服务，满⾜MISEV2018指南对胞外囊泡的鉴定要求；
 

（4）更领先的建库策略：采⽤独有的微量建库技术，极⼤提⾼建库成功率；
 

（5）更合适的技术⽅案：针对不同的外泌体ncRNA(miRNA、lncRNA、circRNA)研究热点，量⾝打造最优解决⽅案。
 

3、数据分析

3.1 标准信息分析
（1）数据过滤及质量评估
（2）核糖体RNA去除率计算
（3）比对参考基因组及统计
（4）基因表达水平分析
（5）基因表达差异及聚类分析
（6）差异基因KEGG生物通路富集分析（仅限于模式物种）
（7）差异基因GO功能富集分析（仅限于模式物种）
（8）已知mRNA表达量分析
（9）已知mRNA差异表达及聚类分析
（10）已知lncRNA表达量分析
（11）已知lncRNA差异表达及聚类分析
（12）预测新lncRNA
（13）新lncRNA鉴定和表达量分析
（14）新lncRNA差异表达及聚类分析
（15）新lncRNA家族分析
（16）SNP和Indel检测与注释
（17）生物学重复样品间相关性分析
（18）蛋白互作网络分析
（19）基因融合
（20）主成份分析（PCA）
（21）特征性差异表达基因分析
（22）lncRNA保守性分析
（23）可变剪切
3.2 高级分析
（1）已知mRNA-lncRNA共表达网络构建
（2）基因结构优化及优化基因的表达值计算
（3）eQTL分析

4、技术流程



5、案例分析
       案例（1）外泌体传递lncARSR以提升肾癌细胞的舒尼替尼抗药性
舒尼替尼耐药是晚期肾细胞癌（RCC）治疗的一个难点。了解这一耐药现象的机制并制定抑制舒尼替尼耐药的有效策略是目前临床应用中面对的重要问题。该研究确定了一个与舒尼替尼抵抗相关的lncRNA（命名为lncARSR）。在RCC细胞中，lncARSR通过竞争性结合miR-34/miR-449来促进AXL和c-Met表达而赋予细胞舒尼替尼抗性。此外，具有生物活性的lncARSR可以被纳入外泌体并被传输到舒尼替尼敏感性RCC细胞，从而传播舒尼替尼抗性。对舒尼替尼抗药性RCC施加舒尼替尼的同时靶向关闭lncARAR或同时施加AXL/c-MET抑制剂可以有效缓解肿瘤细胞对舒尼替尼抵抗。因此，lncARSR可用作预测和治疗舒尼替尼耐药的潜在治疗靶标。

图1 lncARSR RCC舒尼替尼抗性信号通路的作用机制

       案例（2）前列腺外泌体中lncRNA富含miRNA种子序列
       本研究中分析了在几组前列腺癌的外泌体和其亲代细胞系的lncRNA表达情况。研究发现，不同肿瘤细胞系来源外泌体均富含某些lncRNA。这些外泌体lncRNA本身富含miRNA种子序列，包括let-7家族成员以及miR-17，miR-18A，miR-20a，miR-93和miR-106b。并且在外泌体中同时伴随高丰度相同种类的miRNA。此外，外泌体lncRNA也含有RNA结合蛋白的结合序列，最常见的两种基序是ELAVL1和RBMX。鉴于外泌体lncRNA富含miRNA种子序列与RBP部位，其相互作用可能会在前列腺癌癌变过程中发挥重要功能。

图1 前列腺细胞外泌体中lncRNA的数量和表达差异

参考文献
[1] Qu et al. Exosome-transmitted lncARSR promotes sunitinib resistance in renal cancer by act-ing as a competing endogenous RNA. Cancer Cell, 2016.
[2] Ahadi et al. Long non-coding RNAs harboring miRNA seed regions are enriched in prostate cancer exosomes. Scientific Reports, 2016.

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