Exosomes作为活细胞分泌的含有RNA和蛋白质的微囊，大小为30-100nm，广泛分布于外周血、尿液、唾液、腹水、羊水等多种体液中。最新研究表明，体液中exosomal RNA（特别是miRNA、lncRNA和circRNA）在不同的疾病模型中存在明显的表达差异。同时，这些分子被exosomes的脂膜所包裹和保护，能保持其原有稳定性和 生物学功能，有望成为液体活检的重要分子标志物。
       环状RNA（circular RNA）是最近发现的一类特殊的非编码RNA，它大量存在于真核细胞胞质内，是mRNA在剪接的过程中，上游exon的5’端与下游exon的3’端剪接到一起，从而形成的首尾相接的环状RNA分子。
       近年研究发现，高等动物中环状RNA的种类和含量远远超过预期。circRNA具有很多重要的调控功能，例如，circRNA可以作为竞争性内源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）结合胞内miRNA，阻断miRNA对其靶基因的抑制作用。除此以外，circRNA也具有调控其他类型RNA、调节蛋白质活性等功能。circRNA在不同物种中具有保守性和组织表达特异性，且circRNA对RNase不敏感，因此它比线性RNA更为稳定，所以circRNA在疾病新型诊断与治疗方法研发方面有巨大潜力和重要意义。

1、实验方案
     测序平台和方式：Illumina 平台   PE150
     数据量：12G clean data/样

2、数据分析
（1）测序质量评估：
              原始数据过滤统计
              Clean数据碱基组成和质量分布图
（2）比对结果统计：
              比对数据Reads数分布统计
（3）circRNA鉴定：
              circRNA统计列表
              circRNA的长度分布
              circRNA的来源分布
              已知circRNA的注释
（4）circRNA的表达水平及差异表达分析：
              circRNA的表达水平分析
              circRNA的差异表达结果
              两两样本之间的差异表达
              样本间共享和特有circRNA统计分析
（5）circRNA的来源基因分析：
              circRNA来源基因的GO富集分析
              circRNA来源基因的KEGG富集分析
（6）circRNA与miRNA的结合位点预测分析


3、技术流程


4、案例分析
       案例（1） 外泌体circRNA可作为肿瘤诊断的生物标志物
       研究人员首先分离得到了来自于MHCC-LM3肝癌细胞的外泌体并且对其进行了circRNA-Seq。数据分析结果表明，在细胞和外泌体中分别检测到了5484个和6751个circRNA。研究人员将这些在外泌体中存在的circRNA命名为exo-circRNA。与细胞中的circRNA的表达水平相比，exo-circRNA在外泌体中的含量至少富集了2倍。circRNA同miRNA的结合早有报道，巧合的是miRNA在外泌体中也广泛存在。研究人员还关注了miRNA与circRNA的结合对circRNA在外泌体中数量的影响。由于CDR1as circRNA是miR－7的海绵体，研究人员将miR-7引入细胞与外泌体中，借此观察CDR1as的表达量。研究人员观察到CDR1as表达量在外泌体中大幅下降，却在细胞中略有上升。该结果表明，circRNA在外泌体中的确会受到miRNA表达量的影响和调控。
 
图1 circRNA在外泌体中受到miRNA表达的调控


       案例（2） KRAS突变细胞分泌的外泌体中环状RNA的表达情况
       研究者用三种同源KRAS突变结肠癌细胞系建立了环状RNA文库，每种细胞系设有两个生物学重复，且不使用RNase R处理。经过一系列检测和RNase R处理验证，最终确定在三种目标细胞系中可以识别和量化大量的环状RNA，且环状RNA对RNase R处理具有抗性。接着，研究者检测环状RNA的表达水平是否受KRAS调控，比较了三种细胞系中候选RNA的水平。发现环状RNA在KRAS突变细胞中被下调，且环状RNA调控在主基因中能独立出现。为了检测结肠癌细胞分泌的外泌体中能否检测到环状RNA，研究者还对三种细胞系的外泌体RNA进行了RNA-seq分析，并用qRT-PCR对结果加以验证，每种细胞系设有三个生物学重复。结果表明，环状RNA具有复杂的外泌体穿梭机制。与KRAS突变型细胞衍生的外泌体相比，野生型中RNA结合蛋白的丰度更高。
 
图1 qPCR验证3个细胞系外泌体中候选circRNA和host gene的表达量


参考文献
[1] Li et al. Circular RNA is enriched and stable in exosomes: a promising biomarker for cancer diagnosis. Cell Research, 2015.
[2] Dou et al. Circular RNAs are down-regulated in KRAS mutant colon cancer cells and can be transferred to exosomes. Scientific Reports, 2016.

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