环状RNA（circular RNA）是近年来发现的一类特殊的非编码RNA，它大量存在于真核细胞胞质内，是mRNA在剪接的过程中，上游exon的5’端与下游exon的3’端剪接到一起，从而形成的首尾相接的环状分子。
       研究发现，高等动物中circRNA的种类和含量远远超过预期。circRNA具有很多重要的调控功能，如circRNA可以作为竞争性内源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）结合胞内miRNA，阻断miRNA对其靶基因的抑制作用。除此以外，circRNA也具有调控其他类型RNA、调节蛋白质活性等功能。circRNA在不同物种中具有保守性和组织表达特异性，且circRNA对RNase不敏感，因此它比线性RNA更为稳定，所以circRNA在疾病新型诊断与治疗方法研发方面有巨大潜力和重要意义。

1、实验方案
       测序平台和方式：Illumina 平台   PE150
      数据量：12G clean data/样

2、技术优势
（1）多物种选择：可直接对人、大鼠和小鼠样本进行最全面的circRNA分析，亦可发现新的circRNA（其他物种需特殊评估）；
（2）高精确度：数字化信号，可预测到基因家族中相似基因以及不同可变剪切类型产生的circRNA序列信息；
（3）高覆盖度：新一代高通量测序技术的高深度覆盖，可以检测到低丰度的稀有circRNA。
   
3、数据分析
（1）测序质量评估：
              原始数据过滤统计
              Clean数据碱基组成和质量分布图
（2）比对结果统计：
              比对数据Reads数分布统计
（3）circRNA鉴定：
              circRNA统计列表
              circRNA的长度分布
              circRNA的来源分布
              已知circRNA的注释
（4）circRNA的表达水平及差异表达分析：
              circRNA的表达水平分析
              circRNA的差异表达结果
              两两样本之间的差异表达
              样本间共享和特有circRNA统计分析
（5）circRNA的来源基因分析：
              circRNA来源基因的GO富集分析
              circRNA来源基因的KEGG富集分析
（6）circRNA与miRNA的结合位点预测分析


4、技术流程


5、案例分析
       案例（1）环状RNA促进结肠癌增殖和转移
       研究者对正常组织和肿瘤结肠组织样本进行了circRNA测序，结果发现大量在肿瘤细胞中特异性升高的circRNA，其中一些circRNA得到了RT-PCR实验结果的验证。研究人员对其中一类新的circRNA——circCCDC66的功能进行了深入研究。结果表明circCCDC66在息肉和结肠癌中表达水平升高，并且与不良预后相关。通过在结直肠癌细胞系中进行功能获得性研究和功能缺失性研究，研究人员证明circCCDC66能够控制多个生理过程，包括细胞增殖、迁移、侵袭和非贴附性生长等。进一步的研究表明circCCDC66通过调节一系列癌基因来发挥它的功能，并且在异种移植肿瘤模型和原位模型中敲低circCCDC66的表达均能够抑制肿瘤生长和侵袭。
       以上发现表明，环状RNA在癌症发生和转移过程中发挥癌基因功能。该研究为了解环状RNA与癌症之间的关系以及寻找新的癌症治疗手段提供了重要参考信息。 

图1 circCCDC66促进结肠癌增殖

       案例（2）circHIPK3通过结合miRNA来调节细胞生长
       对6个正常组织和7个肿瘤组织测序，共鉴定出27296个circRNA分子，超过80%的环状RNA分子起源于外显子（exon）区。这些circRNA在正常组织和肿瘤组织中存在表达差异。进一步分析发现一个来源于2号外显子HIPK3的circHIPK3，它存在18个结合位点能够与9个miRNA结合，从而抑制细胞生长。

图1 不同组织circRNA的表达差异
 

图2 七个癌组织和对应正常组织中鉴定的特异性circRNA的数目
 

图3 circRNA表达丰度多维图

参考文献
[1] Hsiao et al. Noncoding Effects of Circular RNA CCDC66 Promote Colon Cancer Growth and Metastasis. Cancer Research, 2016.
[2] Zheng et al. Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs. Nature Communications, 2016.

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