由于有商品化的试剂盒，ELISPOT操作本身已经大大简化。目前的ELISPOT试剂盒按抗体的包被情况分为已包被板的和未包被板的两类。前者实验操作简单，但是背景较高，且价格较贵，所以应用不如后者广泛。按照ELISPOT底板材料分，可以分为PVDF膜板和非PVDF膜板。PVDF板由于疏水性的问题，需要用乙醇预先润湿，在洗涤过程中也更复杂一些。各个公司的试剂盒使用起来大同小异，我们以荷兰U-Cytech公司的PVDF板IFN-γ试剂盒威力，列出其操作方法。

　　1、实验的准备工作

　　（1） 设备与耗材：

　　超净工作台；

　　5% CO2 37°C 细胞培养箱；

　　P20， P200， P1000 微量移液器；

　　P300 8通道微量移液器，P300 12通道微量移液器；

　　Biosys ELISPOT Reader

　　P20， P200， P1000 枪头；

　　多道移液器吸槽；

　　0.5mL，1.5mL EP管。

　　（2）溶液配制

　　PBS： 用分析纯试剂，Millipore级别的纯水配制，高压灭菌。

　　PBST： PBS加入0.05% Tween-20，注意无菌操作。储存于20-25°C，可存放一个月。

　　70%乙醇：分析纯乙醇70mL，加入Millipore级别的纯水至100mL。

　　30%乙醇：分析纯乙醇30mL，加入Millipore级别的纯水至100mL。

　　包被抗体（coating antibody，Primary antibody）：照U-Cytech说明书，加入双蒸水溶解。使用时，用PBS稀释50倍，每孔50μL。

　　封闭液：用PBS将试剂盒中的封闭存储液（Blocking stock solution R）稀释10倍，每孔200μL。

　　抗体稀释液：注意，只是用来稀释检测抗体和酶联亲和素。用PBS将试剂盒中的稀释存储液（Dilution buffer R）稀释10倍

　　检测抗体（Biotinylated detector antibody，Secondary antibody）：照U-Cytech说明书，加入双蒸水溶解。使用时，用抗体稀释液稀释100倍，每孔100μL。

　　酶联亲和素（Streptavidin-HRP conjugate）：照U-Cytech说明书，加入双蒸水溶解。使用时，用抗体稀释液稀释100倍，每孔100μL。

　　AEC显色液： 照U-Cytech说明书，用100mL 30%乙醇溶解底物缓冲液胶囊（Substrate buffer capsule），然后加入3.3mL AEC储存液（AEC stock solution），混合均匀后10mL每支分装，-20oC保存。使用时，解冻，每孔加入100μL。

　　PHA刺激物： 将储存液（2mg/ml， Murex）分装成20μL/EP管，-20°C长期冻存。使用时，加入980μL U-Cytech无血清培养基（或者1640基本培养基），成为工作液（40μg/mL，10倍终浓度），每孔加入10μL，终浓度4μg/mL。

　　U-Cytech无血清培养基：我们推荐无血清ELISPOT技术，它能排除血清的干扰，结果更加稳定可靠，背景也更好。如果没有，可以用含10%血清的1640培养基代替。

　　2、ELISPOT标准操作程序

　　（1）第一天：ELISPOT包被程序

　　设计好试验，把每个孔要加入的内容做成卡片，到时候就会从容很多。

　　每孔加入15μL 70%的乙醇预湿30秒。

　　注意：

　　未润湿的PVDF膜是洁白的、不透明的，经过乙醇润湿之后，颜色变暗，变成半透明状，很容易观察二者的区别。

　　加乙醇的时候，枪头应该靠在孔壁接近孔底的地方，注意枪头不到刺到PVDF膜。

　　有时候，加入的乙醇挂在孔壁上，这时要盖上板盖，轻轻叩击，让乙醇顺势滑落。乙醇一旦接触到PVDF膜，就会在表面张力和毛细作用之下迅速浸润整块膜，使得膜的颜色和透明度发生变化。

　　15μL是经过优化的体积，它能保证刚好完全浸润整块膜，而不会有剩余。如果加大使用量，乙醇溶液就会透过膜而积存在膜的背面，加深实验的背景。

　　加入100μL去离子水洗涤三次，尽量减少乙醇的残留。

　　按照试剂盒的使用说明，将包被抗体储存液稀释在PBS缓冲液中，每孔加入50μL，4°C包被过夜。

　　（次日）倾倒包被液，用PBS洗涤5次，最后一次，在灭菌的吸水纸上扣干。

　　加入200μL试剂盒自带的稀释好的封闭液，37°C封闭1小时。

　　倾倒封闭液，无须洗涤，直接可以进行细胞培养。（也可以用PBS缓冲液或者纯水洗涤一次，拍干，封口，4°C保存，可以在4°C保存数周。）

　　（2）第二天：铺细胞，加入刺激物，培养

　　整个实验设置一组正对照（PHA刺激），每一个细胞样品（同一个捐献者或者实验动物）要设一个负对照（不加刺激物），整块板还要加一个背景负对照（不含细胞，只加培养基和所有的检测试剂）。

　　填好实验卡片，用以指导实验的安排和细胞及试剂的添加。每一个细胞/刺激物的组合设置2-4个孔的重复（想要有统计学的意义，每个细胞/刺激物设4个孔的重复）。

　　取出封闭好的板，准备加入细胞。如果是以前做的封闭，可以加入200μL的U-Cytech无血清培养基，室温静置10分钟，倾倒，然后再重复一次。

　　按照实验卡片的安排，加入不同浓度的细胞，100μL/well，细胞在孔中的分布要尽量均匀（要诀是加入细胞之后，不要再震动或者拍击ELISPOT板。有人认为拍击板子会让细胞更分散，实际情况刚好相反）。正对照的细胞浓度为1x105/well，实验组的样品细胞浓度请自行调整。

　　加入100μL的U-Cytech无血清培养基到背景负对照孔。

　　正对照孔加入10μL PHA，终浓度4ug/mL，该浓度能有效刺激IFN-γ的分泌。

　　加入实验者自己的刺激物（配制成10X终浓度，10μL/well）到实验孔。加完刺激物之后不要再拍击ELISPOT板。有人认为拍击板子会让刺激物在孔中混合均匀，实际上，通过扩散，刺激物也会很快混合均匀。拍击板子会让细胞成圈的分布在孔的外周。

　　当加完所有的样品之后，盖上板盖，放入二氧化碳培养箱，37°C培养18-24小时。注意在整个培养过程中避免移动、碰撞培养板。为了取得更好的结果，甚至开关培养箱的箱门也应该禁止。因为碰撞会造成细胞的移位，造成斑点的模糊、拖尾。

　　（3） 第三天：培养后操作

　　倾倒孔内的细胞及培养基。

　　低渗法将细胞裂解，每孔加入200μL冰冷的去离子水，将板置于冰上冰浴10分钟。

　　每孔用200μLPBST洗涤10遍，洗涤最后一遍之后，将板倒扣在吸水纸上拍干。

　　按照试剂盒说明的浓度，用抗体稀释液稀释检测抗体，每孔加入100μL生物素标记的检测抗体，37°C 1小时。

　　每孔用200μL PBST洗涤5遍，洗涤最后一遍时，将PVDF膜板的背面的塑料保护层取下，同时洗涤膜的正反两面，盖上保护层，将板倒扣在吸水纸上拍干。

　　注意：

　　洗涤膜的背面，我们摸索出的办法是，在一个浅托盘中盛上干净的PBST，将膜板的底面浸入，轻轻摇晃几次即可。注意，一定要将膜的背面和塑料保护层上的液体甩干之后，再合拢，盖上，不要伤害到膜。

　　按照试剂盒说明的浓度，用抗体稀释液稀释酶标的链霉亲和素，每孔加入100μL，37°C 1小时。

　　每孔用200μL PBST洗涤5遍，洗涤最后一遍时，将PVDF膜板的背面的塑料保护层取下，同时洗涤膜的正反两面，盖上保护层，将板倒扣在吸水纸上拍干。

　　照试剂盒的说明，解冻已配好的AEC显色液。每孔加入100μL的显色液，室温静置20-30分钟，注意避光。

　　待斑点生长到适合的大小之后，以去离子水洗涤2遍，终止显色过程。将板倒扣在吸水纸上，拍干细小的水珠，之后取下保护层，放在通风的地方，室温静置10-30分钟，让膜自然晾干。注意不要将板放到烤箱内，防止膜发脆、破裂。

　　将ELISPPOT板置于Biosys Bioreader4000 PRO自动读板仪内，调节好合适的参数，半点计数，并记录斑点的各种参数，作统计分析。