1、ELISPOT技术的标准化

　　为了提高ELISPOT检测结果的可重复性，增加实验的可信度，必须建立一套标准化的实验操作规范（Janetzki S et. al.， 2005）。标准化的实验操作规范不仅仅是一些实验操作，更是一个系统工程，需要提升到实验室管理与制度架构上来建设。这包括实验室制度的建立，实验人员的培训，实验程序的建立和标准化，实验设备、试剂、耗材的选择与标准化等等。单就实验流程而言，标准化规范从实验样品的采集阶段就开始了，一直延续到整个实验的结束，即数据分析处理的完成（Janetzki S et. al.， 2005）。

　　影响到ELISPOT斑点频率的因素很多，但是最重要的影响因素可以归结为三个：其一，被检测细胞的状态；其二，整个实验过程中细胞所接触到的内毒素以及其它敏感成分；其三，刺激物的质量与纯度。

　　（1） 细胞状态

　　这是一个很难量化的主观概念。尽管量化困难，但是长期做ELISPOT检测的实验者都能够感觉到：凡是状态好、活力高、功能保持完好的细胞，ELISPOT检测时必定背景干净，负对照斑点少，实验组的斑点圆润漂亮，并且结果的可重复性好，数据真实可信。反之亦然。

　　如何保持细胞的良好状态呢？根据不用的情况有不用的应对措施。做ELISPOT检测的细胞可以分为两类，一类是新鲜分离的细胞，还有一类是经过冻存复苏的细胞。对于前一类细胞，为让细胞始终处于最佳的状态，需要采取经过优化的、标准化的细胞分离方法，经量减少机械损伤（比如通过机械方法将小鼠的脾脏分解成单个细胞）和有毒的化学物质（比如淋巴细胞分离液）对细胞的损害。而对于冻存复苏的细胞，情况就更加复杂了。冻存与解冻对细胞本身就是很大的伤害。在细胞冻存中还会使用一些保护剂（比如DMSO），能减少冻存对细胞的伤害，但是这些保护剂本身就具有生物毒性，也会伤害细胞，影响细胞的状态。可是说，ELISPOT技术对细胞的冻存与复苏提出了更加严格的要求，不单单要求细胞的存活率高，还要求细胞的免疫功能在冻存前后不发生改变。因此，传统的细胞冻存、复苏方法已经不能适应新的要求了。国外较早开展这方面的研究，从理论与实践上已经摸索出了一套行之有效的适应ELISPOT功能检测要求的细胞冻存、复苏方法，可以保证很高的存活率（90%），并且斑点形成细胞SFC频率保持不变（Maecker HT et. al.， 2005）。有些公司已经把细胞冻存、复苏程序经过优化而固定下来了，还开发了相应的细胞冻存液，可以对细胞提供额外的保护。比如荷兰U-Cytech公司推出的冻存液，专门针对做ELISPOT检测的细胞，辅以标准化的冻存、复苏程序，效果卓越。

　　（2）内毒素

　　内毒素，即使是很低的浓度，也可以非特异性的刺激T淋巴细胞，使其分泌细胞因子。所以它对ELISPOT斑点频率有着非常大的影响。控制ELISPOT检测中的活细胞所接触到的内毒素，要从各个关口严格控制。最先控制的是ELISPOT试剂，要选择口碑好的、产品内毒素含量低的产品。其次要控制培养基和血清。最好选购低内毒素的产品，每一批次要做验证。最后，要控制整个实验操作，做到严格无菌。特别指出的是血清，除了含有内毒素，会增加负对照的斑点数目之外，还可能含有其它未知ELISPOT敏感成分，或者增加或者抑制斑点的生成。这在以往的报道中已经屡见不鲜。为了彻底解决这一问题，最好采用无血清ELISPOT技术。即在ELISPOT刺激孵育中使用不含血清的培养基。目前，适用于人的PBMC细胞的无血清培养技术已经成熟，荷兰U-Cytech公司开发了专门针对于人的PBMC细胞的ELISPOT无血清培养基，化学成分完全限定，和ELISPOT兼容，完全消除了血清对检测的干扰作用。

　　（3）刺激物

　　选择特异性的刺激物，有一个原则，那就是：成分尽可能简单，纯度尽可能高。所有首推T细胞表位肽。它的成分简单，特异性也最好。但是由于涉及到MHC分子类型匹配的问题，如果不知道实验对象的MHC类型的话，可能要多选择几个T细胞表位肽，验证实验效果。其次推荐重叠多肽池。如果没有抗原蛋白的T细胞表位信息，也无相应的文献可以参考，那最好选择重叠多肽池。目前的生物信息学有了长足的发展，可以帮我们预测蛋白质序列上潜在的T细胞表位肽，根据预测的结果，在潜在的T细胞表位肽附近和成一系列的重叠多肽，混合成多肽池，也能对特异性的细胞免疫反应作出有效刺激。以上两类多肽都是人工合成的，特别要注意合成的纯度（最好在90%以上，越纯越好）以及合成过程中的质量控制，注意避免内毒素的污染。再次一级的刺激物是重组蛋白。注意，在大肠杆菌中重组表达的蛋白质完全不可用。因为它含有的大肠杆菌成分以及内毒素高到让人无法接受的水平。最好是选择在哺乳动物细胞中表达的蛋白质，它与ELISPOT的相容性最佳。昆虫杆状病毒载体表达的蛋白纯度比较高，也可以使用。如果使用酵母载体表达的蛋白，需要多做验证，有时候效果也会比较好。如果实在没有办法获得化学成分单一且已知的抗原刺激物而被迫使用成分未知的提取物的话，一定要注意多做验证，多做对照，多做重复孔。一般来说，这类刺激物会产生很多非特异性的斑点，在不同的实验对象个体之间会产生很大的差异，属于不得已而为之。

　　2、ELISPOT检测的质量控制

　　仅仅只有标准化的操作规范，不同实验者、不同实验室的ELISPOT结果还无法直接相互比较。为了做到这一点，还需要有一种定量的质控系统。目前，在国际上的艾滋病疫苗项目需要在不同的国家、不同的实验是共同实施完成。为了评估疫苗的效果，在做ELISPOT质量控制时，采取了核心参比实验室质控的方法（Janetzki S et. al.， 2005）。即让分布在各个地方的前线实验室将有代表性的样品细胞冻存，运输到核心实验室，核心实验室统一对代表样品做ELISPOT检测，以这个检测结果和各个实验室自己的实验结果作比较和校正，然后汇总校正过的全局实验结果。这种定量质控的方式可以称之为“收上来”的质控方式。还有一种相对的定量质控方式。即在一个核心实验室制备号标准品（包括标准刺激物和冻存细胞），然后分发到参与质量控制的各个前线实验室。各个实验在做ELISPOT检测的同时也顺带做上标准品的检测。如果标准品的实验结果在预先设定的范围之内，那么前线实验室的该批ELISPOT检测结果就是可信的，可接受的。如果各个前线实验室的检测都以同一种标准品做质控，并且在质控范围之内，那么这些实验室之间的ELISPOT结果就是可以相互比较的，能够共同参与实验数据的统计分析。

　　ELISPOT数据处理与自动读板设备

　　ELISPOT检测的最终数据是细胞频率，即在细胞群体中，受某种特异性抗原的刺激而分泌某种细胞因子的阳性细胞的比例。细胞的总数在一开始已经技术过了。需要统计的是阳性细胞（也称斑点形成细胞spot forming cell SFC）数目。根据以前的技术研究，我们可以肯定，每一个ELISPOT斑点对应唯一一个阳性细胞。所以ELSPOT数据处理最重要的工作就是进行斑点计数。

　　手工计数一般是使用双筒解剖镜，在放大25倍的解剖镜下，一个孔的底板刚好覆盖一个完整的视野。实验操作人员手持按压式的计数器，对孔内的斑点逐一计数。手工计数最大的优点就是可以利用人脑的智慧与经验：比如可以适应各种大小的斑点，排除各种假阳性的斑点，能辨认复杂的背景下的模糊的斑点，等等。 但是手工计数也有致命的弱点，那就是工作乏味，费时费力。尤其是在实验规模比较大、斑点频率比较高的时候（比如有数快板，每孔有数百乃至上千个斑点），人工计数简直就是实验者的噩梦！此外，人工计数的主观差异也是一个问题，实验者很难在整个计数过程中保持完全相同的斑点判定标准。

　　要实现这个过程的自动化，我们很容易想到显微照相技术、图像处理技术以及计算机人工智能技术。把它们综合到一起，这就是ELISPOT自动读板设备。1992年，德国莱卡公司推出了第一台ELISPOT自动读板仪。然而市场却没打开，因为那时的ELISPOT技术还远远没有现在这么普及，对自动读板仪的需求还不足以支撑起一个商业化的产品。