一、样品制备

　　对于Western Blotting实验而言，样品处理是关键步骤之一，获得的蛋白样品必须均质、可溶，并解离成单个多肽亚基，且尽量减少相互间的聚集，使其最终仅依赖本身的分子量大小进行分离。当目标蛋白的含量很低时，需要选取目标蛋白含量较高的组织或细胞器（如核抽提物），或者通过免疫沉淀等方式进行富集。通常样品有重组蛋白、细胞和组织等。

　　1. 样品收集

　　1）培养的细胞

　　贴壁和悬浮细胞收集方式不同，细胞裂解液种类各异，推荐含SDS的凝胶加样缓冲液裂解，煮沸即可。

　　2）动物组织

　　与细胞不同，组织块由于体积较大，须预先经破碎匀浆处理。

　　2. 样品定量

　　样品电泳前需测定蛋白浓度，以便保证上样量一致，有利于后续定量或半定量分析。常用的蛋白质浓度测定方法有好多种，其灵敏度和所需时间不同，且不同的方法会受不同干扰物质的影响，实验者可根据样品制备方法（裂解液成分、去垢剂和还原剂种类等）自行选择。

　　注意事项：

　　a. 应尽量避免引入影响后续定量的杂蛋白（如细胞培养液、蛋白酶抑制剂等）及其他干扰物质；

　　b. 样品浓度应适中，1×SDS凝胶加样缓冲液建议用量：贴壁细胞按10cm2培养皿/0.1ml,悬浮细胞按5×106细胞/0.1ml比例加入；

　　c. SDS对蛋白质变性和电泳分离至关重要，浓度应控制在2-10%之间，并根据具体需要调整；

　　d. 制备好的样品可以在-20℃保存，但时间不宜过长，并避免反复冻融，否则蛋白会发生降解；

　　e. 内参对实验结果至关重要，应选择合适的内参。

　　二、电泳

　　电泳分为非变形凝胶电泳和变性凝胶电泳，Western Blotting中常用的是不连续缓冲系统下的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），该法中由于变性的多肽与SDS结合而带负电荷，在凝胶电泳中迁移率仅与多肽的分子量相关。凝胶的筛分特性取决于它的孔径，而孔径又是灌胶时所用丙烯酰胺和双丙烯酰胺绝对浓度的函数。

　　注意事项：

　　a. 根据目标蛋白的分子量选择合适浓度的凝胶，以达到最优的分离效果和分辨率；

　　b. 分离胶不宜灌注过满，需要有一定的浓缩胶空间，否则起不到浓缩效果；

　　c. 各泳道上样体积最好大体一致且适中，体积偏差过大会相互挤压导致条带走形，为避免边缘效应，可在未加样的泳道加入等量的样品缓冲液；

　　d. 电泳时应保持电压和电流稳定，且不宜过高，否则会造成不规则的蛋白质迁移带；

　　e. 如有特殊需要，可以使用梯度胶，高浓度丙烯酰胺可以使低分子量蛋白质形成清晰的条带，还能在一块胶内同时分离分子量范围更大的蛋白质。

　　三、转膜

　　蛋白质经SDS-PAGE分离后，必须及时从凝胶中转移到固相支持物上，固相支持物能牢固结合蛋白又不影响其抗原活性，而且支持物本身还有免疫反应惰性，这使其比直接在凝胶上检测更易操作，试剂用量更少，更省时，效果更好。

　　蛋白质从凝胶向膜转移的过程普遍采用电转印法，分为半干式和湿式转印两种模式，与SDS结合的蛋白由于带有负电，在电场中向正极迁移，并最终结合在固相支持物上。两种方法均卓有成效，且各有所长，实验者可根据实验情况不同进行选择。

　　注意事项

　　a. 样品属性、膜类型、胶浓度以及转移缓冲液均会影响蛋白质的转移效率，比如小分子量蛋白与大分子量蛋白相比，迁移迅速，但结合不牢固；

　　b. 蛋白与固相支持物结合的程度受多种因素影响，如膜属性（孔径和类型），缓冲液属性（pH值、盐离子种类、盐浓度、去垢剂等），如实验结果不佳，可分别进行优化；

　　c. 如果转膜与电泳的缓冲液系统不同，转膜前应将凝胶在转膜缓冲液中平衡，防止凝胶膨胀或收缩，以保证条带清晰完整；

　　d. 提高蛋白质转移效率的方法：转移缓冲液中加入甲醇或低浓度的SDS （0.02-0.1%），使用小孔径膜，转移后立即用戊二醛交联；

　　e. 转膜时间和电流大小可根据蛋白分子量大小灵活调整；

　　f. 转移效果可通过染胶（考马斯亮蓝染色或银染）或染膜（丽春红S染色、印度墨汁染色）来鉴定。

　　四、封闭

　　在进行抗体杂交之前，需要采用异源性蛋白质先对转印膜进行封闭，防止免疫试剂的非特异性吸附，从而降低背景，增加灵敏度，提高信噪比。常用封闭物有脱脂奶粉和BSA（稀释于不同的缓冲液中），但不同的抗原-抗体反应，封闭条件均不相同，没有适合所有系统的封闭液，具体封闭条件（包括封闭液浓度、缓冲液种类、封闭时间、温度等）需自行优化。

　　注意事项

　　a. 影响非特异性结合的因素很多，针对不同的免疫原，其封闭条件均可进行优化，没有通用的封闭液，因为每个抗原-抗体反应都具有独特的性质；

　　b. 在选择封闭物时，最重要的标准是信噪比，封闭条件不足，会导致过多的背景噪音，封闭条件过度，会造成信号变弱；

　　c. 可根据不同的检测系统（碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶）、蛋白质属性（分子量大小）选择适当的封闭物及缓冲液（PBS或TBS）。

　　五、杂交

　　封闭后，目标蛋白便与特异性的一抗进行免疫反应，一抗可以是标记的，也可以是非标记的。标记的一抗与免疫原结合后，可直接进行检测（直接法），降低了背景和非特异性结合，但信号较弱。非标记的一抗配合标记的二抗使用（间接法），对信号有级联放大作用，可以增加灵敏性和信噪比。二抗既可标记放射性同位素，也可标记染料或其他分子，或与酶偶联。常用的酶包括碱性磷酸酶（AP）和辣根过氧化物酶（HRP），通过与底物反应产生光信号。

　　注意事项

　　a. 标记方法的选择视灵敏度和易操作性而定，通常有四种标记系统：化学发光、放射性同位素、荧光、化学荧光；

　　b. 一般而言，一抗常用非标记的，但遇到特殊实验需要，可以对一抗进行相应标记；

　　c. 单抗和多抗各有利弊，多抗便宜、制作省时、亲和力高，但特异性不佳；单抗特异性好、纯度高、重复性好，但制作工期长，价格较高；

　　d. 一抗稀释比例及反应条件（温度、时间）视抗体效价而定，并需根据实验结果进行优化，二抗一般可固定一个反应条件（建议1:4000、室温1小时）；

　　e. 清洗步骤对移除未结合试剂、降低背景、增加信噪比至关重要，清洗不够会造成较高背景，清洗过度会导致灵敏度降低，清洗液的成分可适当调整。

　　六、显色发光

　　根据二抗的标记物不同，其显色方法也不同，并通过胶片或影像系统（CCD）收集。较常用的检测系统有HRP标记二抗的增强化学发光（ECL）和DAB检测系统。

　　注意事项

　　a. 根据不同的实验目的和需要（定量、半定量）选择不同的检测系统；

　　b. 反应液应覆盖均匀，尤其是边缘部分；

　　c. 信号应尽快采集，防止时间过长，导致信号失真；

　　d. 信号强度应有一个由弱到强的梯度，以免结果信息遗失，区分度不大。