变性条件下的凝胶电泳实验——梯度胶凝胶电泳
| 实验方法原理 | 在凝胶电泳中使用丙烯酰胺梯度胶比使用线性胶有两大优点。一是在高浓度丙烯酰胺条件下可以增加蛋白质的分子筛作用，从而使低分子量蛋白质形成淸晰的条带。另一是梯度胶可以在块胶内分离分子量范围更大的蛋白质（如 5％～20％ 的凝胶可以分离 15 kDa～200 kDa 的蛋白质；而 3％～30％ 的凝胶可以分离 13～950 kDa 的蛋白质）。丙烯酰胺在梯度胶中的百分比可根据需要来定。 |
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| 实验材料 | |
| 仪器、耗材 | |
| 实验步骤 | 1. 工作溶液 1.1.1 溶液 A 30％ 丙烯酰胺，0.8％ 双丙烯酰胺 1.1.1 溶液 B 15 mol/L Tris-HCl（pH 8.8），0.4％ SDS 1.1.3 溶液 C 0.5 mol/L Tris-HCl（pH 6.8），0.4％ SDS 2. 5％～20％ 分离胶所需的溶液量
3. 制备分离胶 灌制丙烯酰胺梯度胶与线性胶最大的区别在于需要使用梯度仪。恰好在分离胶溶液灌入凝胶模具之前，梯度仪将高浓度和低浓度的丙烯酰胺溶液相混合，在没有蠕动泵的情况下，凝胶溶液依靠重力灌入模具内。高浓度丙烯酰胺溶液内加入蔗糖可以稳定梯度的形成。 3.1 准备好凝胶模具，并装配好梯度混合器。磁力搅拌器置于梯度混合器的下方，这样就不会使混合器的凝胶槽内产热。调节蠕动泵至流速为 3 ml/min； 3.2 准备好未加 TEMED 的分离胶溶液； 3.3 将 TEMED 加至分离胶溶液内，轻轻搅拌混匀，此时动作要迅速，因为凝胶很快会聚合； 3.4 将适量的两种分离胶溶液分别加人到混合器的两个凝胶槽中（例：对于 10 ml 的凝胶，各加 5 ml 至每个槽屮高百分比浓度的丙烯酰胺溶液应加入至 B 槽中； 3.5 打开磁力搅拌器，接通两个槽之间的连通管； 3.6 打开蠕动泵，形成梯度胶； 3.7 当分离胶灌完后，在胶的顶部轻轻覆盖约 1～5 mm 的水层； 3.8 用清水冲洗梯度混合器和连接管，防止残留的丙烯酰胺聚合后堵塞； 3.9 堆积胶的制备。（参见SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳） 展开 |
| 注意事项 | 1. 堵塞在连通管中或梯度仪凝胶槽中的气泡致使形成的梯度不均一。 2. 凝胶溶液放在冰箱 4℃ 预冷，可以延缓灌胶时凝胶聚合的时间。 3. 为了延缓梯度凝胶聚合的时间，可用核黄素來替代过硫酸铵。核黄素的终浓度为 0.0005％（储存液浓度为 0.004％），将凝胶暴露于日光，或白色、蓝色的荧光下即可聚合。 |
