| 实验步骤 |
一材料与设备
1)[α32P]UTP 或 CTP(800Ci/ml,10mCi/ml)。
2)UTP 或 CTP。
3)T4 多核苷酸激酶
4)10XT4 多核苷酸激酶缓冲液
5)(γ32P)ATP(3000Ci/mmol；10mCi/ml)
6) 牛小肠磷酸酶
7)DEPC 处理的水
8)10X 磷酸酶缓冲液
9)TE(pH7.4)
10)5mol/LNaCl
11)TE(pH7.6)
12)T4RNA 连接酶
13)[32P]pCp(3000Ci/mmol；lOmCi/ml)
14)10XT4RNA 连接酶缓冲液
15)DMSO
16)ATP，20umol/L。
17 无 tRNA 酶的牛血清白蛋白
二、操作方法
(一）RNA 内部标记
1) 在体外转录体系中加入 5ul[α32P]UTP 或 CTP(800Ci/ml，10mci/ml），不加未标记的 UTP 或 CTP 或限制它们的浓度为 10〜15umol/L, 孵育时间最长为 1 h
2)DNase 消化后，变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 RNA, 纯化标记的全长 RNA。
(二）5＇端标记 RNA
逋过 T4 多核苷酸激酶在 5＇端标记 RNA。这个酶将 [32P] 由 [γ-32P]ATP 上转移到分子的 5＇端. 伹 5＇端标记的 RNA 分子需要先用牛小肠磷酸酶去除非同位素的 5＇磷酸。
1) 用 DEPC 处理的水稀释 1〜2ugRNA 至终体积为 16ul,95℃ 下放置 2 min 后，冰浴5 min, 变性 RNA
2) 加入 2ul10X 磷酸酶反应缓冲液，2ul 牛小肠磷酸酶 (1U/ul);37℃ 反应 30 min
3) 用 TE(pH7.4) 稀释 RNA 至终体积为 200ul, 加 6ul5mol/LNaCl 如前所述沉淀RNA。
4) 用 TE(pH7.6) 重悬 RNA 至 RNA 浓度为 0.5ug/ul。取 2ulRNA 溶液，95℃ 放置 2 min 后，冰浴 5 min
5) 加 10XT4 多核苷酸激酶缓冲液 4ul[γ32P]ATP(3000Ci/mmol,10mCi/ml),iyT4 多核苷酸激酶 (3〜6U/ul)，于 37°C 孵育 30 min
6) 用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化已标记的 RNA
(三）3＇端标记 RNA
利用 T4RNA 连接酶和过量的 [32P]p4 以标记 RNA 的 3＇端
1) 将 1〜2ugRNA 于 68℃ 放置 2 min 后，冰浴 5 min, 使之变性
2) 加入 4ul10XT4RNA 连接酶缓冲液，4ul DMSO，1ul20umol/LATP,1ul l0ug/ml 无 RNA 酶的牛血清白蛋白，1〜2ug RNA,5〜10ul[32P]pCp(3000Ci/mmol,lOmCi/ml)，用 DEPC 处理水补足总体积 40ul。4°C 孵育过夜。
3) 用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化已标记的 RNA。
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