活体多光谱荧光成像应用实例（二）
优化和多光谱建模
启始成像和研究设置包括用于优化设置和建模的初始步骤：
1- 荧光团成像（体外）
2- 生成光谱模型
3- 体内模型评估
首先，我们建议您使用上文确定的滤光片对稀释后的荧光团进行成像。一旦采集到图像，通过将高斯曲线拟合到荧光团的实验曲线来创建光谱曲线（图7）。
应用光谱模型
一旦光谱曲线实现了优化，模型就可以直接被调用到之后的数据集里，无需修改。如需将现有模型应用到新的数据集中，则选择“分离图像”面板中的“+”，选择所需模型和“分离（Unmix）”按钮（见图 8）。系统采用适合求解多光谱模型的最小二乘法，将模型分配给各个像素（4）。为此，每个像素中的光谱总和需要与参考图谱库中的所有可能的组合总和相匹配。分离算法还添加了一些额外的限制（如非负性）。因此，成功进行光谱分离的关键就在于获取图谱库荧光团的准确光谱。一旦确定各个荧光团中的光谱作用，所采集的叠合图像就可以被分离成各个荧光团的独立图像。
每个“分离”图像都由来自单独“通道”的重叠图像组成（以上述 Alexa 680 和 Alexa 700 为例）。各个图像都可以在布鲁克MI软件中打开，并使用感兴趣区（ROI）应用的相关数据进行分析，例如，平均值、总和和净光强度、面积和周长以及自动ROI查找功能和图像数学。换句话说，相机测量的强度可能与动物体内发光物质释放的“真实”信号强度以复杂方式有相关性。传感器捕捉到信号之后，接下来的多光谱分析可以定量产生准确的成分特定数据（1）.
传染病、肿瘤学和纳米粒子示踪研究中的多光谱成像
使用绿色或红色基因荧光报告或乃至多个 NIR 荧光团的研究可以受益于荧光光谱建模。使用多光谱成像可以识别和建模报告基因的不同光谱曲线，从而减少自体荧光。图 9 和 10 显示了采用多光谱方法扣除组织自体荧光的感染利什曼原虫的兔足垫模型成像（M. Leevy，美国圣母大学，未出版）。
在另一个例子中，多光谱成像被用于一项体内聚合物粒子示踪研究（5）。注射 4 小时后，在肝脏区域（图 11）检测到标记为Cy7 的颗粒，在 GI 区域获得的可能由食物叶绿素产生的串扰信号被分离，提供了颗粒信号的清晰定位。
在一项纳米颗粒/肿瘤研究中，在同一肿瘤小鼠中检测到了不同大小的纳米颗粒生物分布（6）。纳米颗粒被差异标记，多光谱成像也用于分离循环纳米颗粒的信号（图 12）。
释放体内荧光成像的所有潜能
