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应用案例｜活体近红外二区聚甲川荧光染料多色融合成像

2021.2.23

图1:红外二区活体成像：多色荧光融合技术

荧光成像技术使得人类对细胞和微生物的研究能力得到革命性提升，高分辨率多路复用技术是细胞成像的主要手段，然而将该技术应用于哺乳动物身上却有很大挑战性，这是因为传统的荧光成像激发光位于可见光区域（VIS,350-700nm），而哺乳动物组织在可见光区域以及近红外一区（NIR-I,700-1000nm）有较大的散射和自体荧光。在近红外二区（NIR-Ⅱ，1000-1700nm），动物组织光散射与自体荧光大大减少，同时成像深度随波长增加而增加，因此极大提高了成像的空间分辨率。本文作者选择吸收和发射带较窄的花菁染料（Flav）进行结构改造，开发出11个含有不同取代基的染料（如下图1a），采用与传统多路复用使用同一激发波长不同检测窗口相反的方式，作者采用了不同激发波长去激发相匹配的化合物，使用一个InGaAs检测器来接收信号的方式避免了传统方法多通道检测导致分辨率差异的问题。通过从11个化合物中筛选出两个性能最好的染料分别匹配980nm和1064nm的激发波长，结合临床已批准使用的吲哚菁绿（ICG），本文作者实现了实时、三色的高时空分辨成像。

图2：a）不同取代基取代的黄酮类花菁染料；b）和c）分别为对应化合物的吸收与发射图谱。

首先作者选择了980nm和1064nm的激光，一方面是因为这些激光器成本低容易获得，另一方面多通道检测要求两个通道之间至少间隔80nm的波长范围。通过比较作者选择了化合物3（JuloFlav7）用于匹配1064nm激发，化合物10（MeoFlav7）用于匹配980nm激发，ICG则使用785nm的光激发。为了实现实时成像，将毫秒级的触发信号独立发送到每个连续波激光器，并对探测器进行编程，为每一个序列的激发脉冲收集单一帧。作者将化合物3和化合物10用聚乙二醇胶束促溶，分别对比了在有机相和水相的三色成像，发现被胶束促溶后的探针并不影响成像效果。随后作者在小鼠体内腹腔注射MeoFlav7，2min后静脉注射JuloFlav7，最后在4min时注射ICG，如图2g所示，实时多色成像显示出了不同探针在小鼠体内不同部位的相对分布。

图3：e）三种探针在有机相（上）和水相（中）以及线性分离矫正的三色成像；f）注射三种探针的时间线；g）使用785、980和1064 nm激发波长激发和1150-1700 nm范围采集（10ms曝光时间，27.8 fps）的体内多路复用图像。

随后作者探索了实时近红外多色成像的应用。心跳速率、呼吸速率、温度调节、代谢以及中枢神经系统功能受麻醉的影响甚大，观测动物的自然状态对研究生理学是必须的，目前仅限于遥感装置和心电图以及植入装置等手段。快速NIR-II实时成像使得无接触观测苏醒小鼠的生理状态得以实现。由于帧速率比动物的宏观运动更快，因此可以量化清醒动物的心率和呼吸速率。在腹腔注射MeOFlav7和连续静脉注射JuloFlav7和ICG的80分钟后进行清醒的小鼠成像。如下图3a所示，可以在3.2s内看到小鼠的头部的移动轨迹变化，同时通过量化感兴趣区域肝脏的运动测量出小鼠的心率为247/min（图3b）。随后作者利用两个探针ICG和JuloFlav7在肝脏的积累与分布来评估两个探针的生物分布和清除特性，如图3c和d所示，ICG一小时内信号逐渐降低，而JuloFlav7的信号基本保持不变。

图4：a）三色多路复用成像；b）清醒小鼠的心率测量；c）JuloFlav7系统标记ICG清除成像；d）1h内的ICG与JuloFlav7的信号百分率；e）双色活检成像

荧光成像引导的手术过程中，区分与癌症有关的前哨淋巴结和评估淋巴血管疾病中淋巴网络的结构和功能对癌症治疗极为重要。本文作者预先在小鼠足和尾巴皮下注射ICG，40min后ICG聚集在淋巴系统中，随后JuloFlav7胶束静脉注射并立即成像，如图4所示，可以看到在30s左右JuloFlav7显示出大多数血管，与淋巴组织区别开来。这种鉴别淋巴和循环系统并同时监测其功能的能力在非侵入性诊断和扩大荧光引导手术方面具有非凡的意义。

图5：a）注射不同探针的时间线；b）注射JuloFlav7胶束30s后的成像；c）不同时间点的局部放大图片

参考文献：
Cosco E D, Spearman A L, Ramakrishnan S, et al. Shortwave infrared polymethine fluorophores matched to excitation lasers enable non-invasive, multicolour in vivo imaging in real time[J]. Nature Chemistry, 2020, 12(12): 1123-1130.

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红外二区小动物活体荧光成像系统 - MARS

NIR-II in vivo imaging system