染色体显微切割及新进展
提要 染色体显微切割技术是细胞遗传学与分子遗传学相结合的一项桥梁技术。近年来，该技术在同源基因的定位和克隆的价值深受关注。本文结合显微切割的经验，对其应用和新进展进行了综述。
完成人类基因组计划的全序列分析，需要构建基因高分辨遗传图谱和物理图谱，如何快速有效的获得染色体区带特异性的序列标签位点（STS）及表达序列标检（EST），构建克隆连锁群，分阶段有序列的完成特定区带全序列分析，染色体显微切割技术显示出无可比拟的优越性。该技术自80年代初问世以来，通过与PCR、微克隆、FISH、DNA测序、文库筛选、比较基因组杂交等分子生物学技术相结合，在染色病研究与诊断、文库构建、基因定位与克隆、以及进化遗传学与肿瘤遗传学等方面的研究中取得了令人瞩目的成绩，并以其独特的直接性和实用性保持其分子生物学领域良好的应用前景。
一、历史回顾
1981年，德国的欧洲分子生物学实验室（EMBL）Scalenghe等[1]切割了果蝇吃得开液腺多线期X染色体第3段的几个片段，通过蛋白酶消化、酚抽提、EcoRI酶切进行重组克隆。1984年染色体显微切割应用小氧，1986年Bates等[2]切割了人的2号染色体短臂。但当时由于所切割的染色体DNA量少，通常要切割上百条染色体，且其文库也只含几百个微克隆。显微切割技术的第一闪重在突破在于它与PCR的结合，1989年Ludecke等[3]切割了人类G显带染色体，结合PCR技术进行体外扩增，使其工作量大大减小。邓汉湘等[4]则创造性的设计了linker-priner粘端接头，提高了连接效率，增高了文库质量。而1992年Melter等［5］在PCR扩增过程中引入简并引物，在减少工作量的同时，还解决了探针片段受酶切位点限制、文库不全和部分序列高度富集的现象，是染色体显微切割领域的又一重大突破。
二、探针池或文库质量的控制
显微切割是一项极其精细的工作，需要有熟练的技术和严格的防尘措施。通常一个好的文库存至少覆盖50%以上所切割的染色体区域，而且不应存在一些片段在PCR过程中的高度富集，才能保证以后研究中能分离较多的特异性DNA片段。污染的来源可以从以下几个方面进行控制。
1.实验试剂和用具
实验操作台要保持相对无菌，实验操作人员要戴口罩。所用缓冲液应用0.22μM过滤器除菌，切割针对可用紫外线照射30分钟或干热灭菌。尽量使用一次性无菌用品。
2.染色体切割玻片的制备
虽然切割常规G带片段通过FISH杂交得到阳性信号，甚至使用-20℃固定3年的细胞悬液制片也可能有满意的结果[6]，但长时间的酸固定和暴露于空气中可造成克隆插入子片段子[7，8]。Hagng等[9]为减少冰醋酸固定细胞引起DNA降解而采用速固定和乙醇洗脱。
3.切割方法的选择
染色体显微切割分手工切割和激光切割法[10～13]。前者较不常用，其方法是在倒置显微镜上装配切割臂，安上硅化玻璃针，找到分散良好的分裂相来切割所需染色体片段。所切割染色体片段在油室中操作则操作繁琐，而在Eppendorf管中操作污染较多。激光切割法分三步[4]：（1）自动浇灼：常规将所切割的染色体周围核型及细胞核用激光浇灼；（2）手工浇灼：浇灼切割核型内除切割区带以外的染色体；（3）比率确定：精细切割区带边缘。激光能切割不太分散的分裂相，污染小，提高了成功率，但需要较高的设备条件，推广较困难。
4.引物设计
染色体显微切割引物分特异性引物和简并引物。特异性引物有外源性和内源性两种。Ludecke等将内切割片段克隆进puc载体，再用SamI酶切后puc上序列作特异性外源引物PCR扩增后将PCR产物克隆到puc13中，构建了染色体8q23-q24文库。基因定位则常用特异性内源性引物[15，16]，即基因组DNA的一段特性性序列。简并性引物以5%26acute;-CCGACTC-GAGNNNNNNATGTGG-3%26acute;(N=A,T,G,C各25%)[17]最为常用，它比六个简并核苷酸置于3%26acute;末端[18]污染少，但简并性效果差些。简并的引物可自行扩增[19]造成探针池和文库的质量下降，但由于其操作简单，免去酚仿抽提、连接等步骤，又能相对减少污染。Tokayama等采用简并寡核引物穿梭PCR（Dop-shutter-PCR）提高了探针池的特异性。
5.PCR扩增周期
PCR大大减少了切割工作量，提高了成功率，甚至一个
dNA拷贝也能扩增成功[20]。但PCR扩增周期增加会导致文库质量下降，而FISH信号不一定减弱[21]。只要有某些片段在PCR中稍易扩增，就易引起这些片段的富集，Stefank等[18]在66个克隆中发现一个克隆出现8次。然而另一些资料显示，由于简并，PCR扩增呈序列非依赖性，甚至2kbDNA模板也可扩增出不同大小的片段，在琼脂上无明显条带。
三、应用
随着生命科学领域细胞分子水平研究的深入，染色体显微切割在人、果蝇[1]、大鼠[22]、小鼠[23～25]、猪[26]等染色体研究中都有所应用，其应用价值和应用前景主要以有几个方面。
1.染色体水平的研究
应用显微切割构建的染色体特异性和染色体区带特异性探针池，与可疑患者染色体进行正向染色体涂染[27]，或直接切割标记染色体，进行反向染色体涂染，可以用于研究标记染色体[28]，单体、三体、双微体、易位、缺失[29]以及染色体均染区（HSR）的来源、结构和形成机制等。Tigand等[30]用显微切割构建的区带特异性探针池发现脊髓发育不良病人中有5q-;而Engelen等[31]发现了5个断裂点的染色体复杂重排。染色体显微切割在染色体病产前诊断[32]与产后分析中发挥了重要的作用[33]。
2.分子水平的研究
（1）构建染色体特异性和区带异性文库
染色体显微切割、PCR得到的探针长度通常为150～1500bp，一般可以用来构建质粒gDNA文库[34]。而Hozier等[35]将cDNA原位杂交与染色体显微切割结合起来，构建了鼠4号染色体C3-7区带文库。1996年
Yokoyama等[36]从胎脑mRNA反转录合成了第一链cDNA，再用两步扩增法—Dop-shutter-PCR合成短片段cDNA，杂交于包括两个近端着丝粒的K562细胞系中期分裂相，再切割标记染色体，发现81.5%克隆来源于所切割的相应区域，8个单拷贝序列中有5个是新的cDNA序列，仅1个来自于非切割区。应用显微切割所构建的探针池也可通过文库筛选快速分离区带特异性文库[37]Abdel等[38]则分离构建了包括700个Cosmid的12号染色体区带特异性Cosmid亚文库。
（2）构建整条染色体重叠群
关等[21]切割了人类6号染色体13个彼此相邻的不同区带探针池，由此构建了6号染色体重叠群。
（3）构建DNA图谱
STS和EST为DNA制图中一种重要的物理界标。人类基因组计划原定目标是获得分布于整个基因组约30000STS。使每隔100kb就有一个标记。Soejima等[39]通过显微切割分离了11q13.4-q25的50个STS。而建立全基因组的基因图，将加速对简单孟德尔性状基因的搜寻和对复杂性状基因的认识，同时cDNA系列可以申请ZL，这就激发了许多药物公司对cDNA测序的兴趣。用显微切割构建cDNA区带文库，无论是DNA序列分析还是致病基因的定位侯选克隆都有深远意义。
（4）染色体工匀染区（HSR）的研究
HSR是可见的基本扩增区，Xu等[40]发现在小细胞肺癌中11q13有基因扩增后再发生重排。关等[41]则切割了卵巢癌常规G显带中不能确定HSRs的染色体来源。通过与正常核型杂交确定了HSRs的染色体来源。这些选择性扩增区域包括与卵巢癌相关的基因。作者共切割7个病例12个HSR，其中3例有19q13.1-q13.2扩增。已知AKT2是丝氨酸-苏氨酸激酶基因，定位于19q13.1-q13.2，仅在UACC－326系中有AKT2基因扩增，卵巢癌基因侯选区还发现有4q16、15q15、15q22、q16q11-p13、2、16q21和16q24。关等通过显微切割与比较基因组杂交克隆了乳腺癌在20q-q13.2位点的三个相关基因。
（5）克隆易位断裂点
在人类恶性细胞中通达染色体易位已确定几种重要的生长调节序列有关遗传位点，如细胞癌基因和抑癌基因。Zhang等[42]确定了在恶性黑色素瘤基因中t(1;6）（q21;q14）的断裂点，并切割了该裂点区域，建立DNA微克隆文库，分离断裂点附近Cosmid和YAC，鉴定出一跨断裂点YAC。Muir等[43]则发现与头裂畸形相关的平衡易位，这两个断裂点都将有助于克隆易感基因。
（6）确定多发断裂点（断裂热点）
缺换6q为B淋巴胞瘤中最常见的一种染色体畸变。普通细胞遗传学作图分析和杂合性丢失（LOH）研究只检测了几个共同缺失区，而无法确定好发断裂点。关等[44]切割了9例病人畸变的6号染色体。其中5例结果与G显带分析不同，未见末端缺失。4例近着丝粒缺失定位于6q11，1例在6q12，缺失远端各异。其余4例有3例断裂点在6q11,1例在6q12，故可确定断裂热点在6q11。关推测6q11染色体改变可能是影响一个与滤泡淋巴瘤相关基因。或仅仅是因独特结构的一个胞性位点。
⑺基因定位和基因克隆
外生性骨疣（EXT）Ⅰ型、Ⅱ型基因分别定位在8q24.1和11p11,其中EXT1已被克隆。邓等[45]首次应用11p11显微切割探针池筛选500000个克隆的骨胳肌cDNA文库，得到12个阳性克隆，测序发现一个克隆与EXT1基因在总长度500bp的两个区有58%和59%的相似，再以之为探针筛选人脑干和胎盘cDNA文库,得到了EXT2基因的两个转录本,从而克隆了该基因。人心脏河豚鱼毒素耐受性电压闸门Na+通道α-体亚单位基因（SCN5A）通过体细胞杂交定位于3号染色体上。Georage等[15]分别切割染色体3pter-q21，3p14-qter,3p22-qter,3pter-p22,3p21，再以SCN5A基因上特异性序列设计引物进行PCR确定SCN5A位于3p21。基因作图对于正确估价遗传病综合征的侯选基因很有价值，3号染色体上还存在有其它电压依赖离子通道基因（CACNLIA2，定位于3p14.3），编码确定α-亚单位二氢吡敏感性钙通道，在脑和神经内分泌组织中表达，这对于3号染色体上其它电压离了通道基因相关特异性分析很有帮助。Shelley等[16]通过人鼠杂种细胞板用PCR确定人β2基因内含子的特定序列。为证实β2基因是否为5号染色体基因族的一个，分别切割5q32-q33与5q34-q35，用β2特异性引物扩增，5q34-q35出现198bp条带，从而确定β2基因位于5q34-q35,这是通过原位杂交无法做到的。这对于同源基因定位非常有效。
(8)进化研究
Ambady等[26]切割猪6号染色体构成的探针池，与人的中期分裂相染色体进行染色体涂染，发现其与人1p和1q同源，从而通过种间比较可确定基因簇、数量线状位点（quantitative trait loci,QTL）和进行其它物种基因的快速定位与克隆。
四、展望
染色体显微切割技术是细胞遗传学与分子遗传学相结合的一种桥梁技术，结合其它技术，已在人类基因组工程与遗传病等研究与应用中取得了不少的成果。由于其独特的直接性，可减少污染，拓宽遗传学研究范围，如切割小昆虫体细胞染色体，这是流式细胞分类等技术难以比拟的；构建全基因组区带特异性cDNA文库将对遗传病致病基因的定位侯选克隆有所帮助；同源基因的精确定位也有了一种精确有效的方法。在对整个基因组结构、组成和功能进行进一步的研究中，染色体显微镜切割将发挥更为重要的作用。
