使用酶联免疫吸附测定法分析赭曲霉毒素
赭曲毒素是赭色曲霉属和几种青霉属真菌产生的一种毒素,包括 A,B,C 等7种结构类似的化合物,其中以赭曲毒素 A 毒性最大。下表列出了世界各国对各种商品中赭曲毒素 A 存在情况的研究结果。
用赭曲霉毒素 A 作为半抗原,与牛血清白蛋白(BSA)或人γ球蛋白结合,制成复合抗原,免疫动物,产生特异性的抗血清或单克隆抗体,并建立起酶联免疫吸附测定法。Candlish 等人1986年首次报道了抗赭曲霉毒素A的单克隆抗体。卫生部食品卫生监督检验所也已制备出高特异性的抗赭曲霉毒素单克隆抗体,建立了直接竞争性酶联免疫吸附测定法(直接法)和间接竞争性酶联免疫吸附测定法(间接法)。
(1)直接法
①原理
将已知抗原吸附在固相载体表面,洗除未吸附的抗原,加入一定量的酶标记抗体与样品(含有抗原)提取液的混合液竞争温育后,在固相载体表面形成抗原抗体酶复合物。洗除多余部分,加入酶的底物在酶的催化作用下,底物发生降解反应,产生有色物质。通过酶标检测仪,测出酶底物的降解量,从而推知被测样品中的抗原量。
②试剂
a.化学药品:赭曲霉毒素A,四甲基联苯胺,甲醇,石油醚,三氯甲烷,无水乙醇,乙酸乙酯,二甲基甲酰胺,吐温-20,30%过氧化氢等。
b.缓冲液
包被缓冲液:50mmol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液,PH9.6。
洗液:含0.05%吐温-20的磷酸盐缓冲液,PH7.4。
样品与标准毒素稀释液:含20%甲醇的洗液。
底物缓冲液:0.1mol/L的磷酸-柠檬酸缓冲液,PH5.0。
底物溶液:取50μL 四甲基联苯胺溶液,加10mL 底物缓冲液、10L 30%过氧化氢混合均匀。
终止液:1mol/L 硫酸溶液。
c.赭曲霉毒素 A 标准溶液:用甲醇配成1mg/mL赭曲霉素 A 贮备液,20℃冰箱贮存。于检测当天,精密吸取贮备液,用稀释液稀释成制备标准曲线所需浓度。
d.包被抗原:赭曲霉毒素 A 与载体蛋白牛血清白蛋白的结合物。
e.抗体:抗赭曲霉毒素 A 单克隆抗体与辣根过氧化酶结合物。
③测定方法
a.提取与净化 称取20g 粉碎样品,置200mL 具塞锥形瓶中,加入30mL 石油醚和100mL甲醇-水(55+45)。振荡30min 后,通过快速定性滤纸滤入分液漏斗中,待下层醇-水层分清后,取出20mL 滤液,置于100mL 分液漏斗中,用 PH 试纸测试,一般为5～6加入25mL 三氯甲烷振摇2min,静置分层后放出三氯甲烷层于另一分液漏斗中,再用10mL 三氯甲烷重复振摇提取甲醇-水层,将三氯甲烷层合并于同一分液漏斗中,加入50～100mL 4%氯化钠溶液,振摇放置,待三氯甲烷层澄清后,用脱脂棉擦干分液漏斗下端,放三氢甲烷层于蒸发皿中,将蒸发皿置蒸汽浴上通风挥干。用约8mL 三氯甲烷分次将蒸发皿中的残渣溶解,转入具尾管的10mL 浓缩瓶中,置80℃水浴锅上浓缩至干,加0.5mL 的稀释液溶解残渣,摇匀,供本法加样之用。
b.具体步骤 用包被抗原(10μg/mL)包被酶标板,每孔100μL,4℃过夜;酶标板用洗液洗3次,每次3min 后,加入不同浓度的赭曲霉素 A 标准溶液(制作标准曲线)或样品提取液(检测样品毒素含量)与抗体酶结合物溶液(1:400)的混合液(1:1,每孔100μL,该混合液应于使用的前一天配好,4℃过夜备用),置37℃1.5h;
酶标板洗3次,每次3min 后,加入底物溶液。每孔100μL,37℃30min。用终止液终止反应,每孔50μL,于波长450nm 处测定 OD 值。
c.结果判定 若样品检测孔所测得 OD 值大于(或等于)阳性对照孔 OD 值,该样品为阴性;反之,则为阳性。阳性样品毒素含量可根据下列公式计算。
赭曲霉毒素
式中C——酶标板上所测得的赭曲霉毒素A的量,ng,根据标准曲线求得;
V1——样品提取液的体积,mL;
V2——滴加样液的体积,mL;
D——样液的总稀释倍数;
M——称取样品量,g。
(2)间接法
①原理 将已知抗原吸附在固相载体表面洗除未吸附抗原,加入一定量抗体与待测样品(含有抗原)提取液的混合液,竞争温育后,在固相载体表面形成抗原抗体复合物。洗除多余抗体成分,然后加入酶标记的抗球蛋白的第二抗体结合物,与吸附在固体表面的抗原抗体复合物相结合,再加入酶的底物在酶的催化作用下,底物发生降解反应,产生有色产物,通过酶标检测仪,测出酶底物的降解量,从而推知被测样品中的抗原量。
②试剂
a.化学药品:同直接法。
b.缓冲液系统:同直接法。
c.赭曲霉毒素A标准溶液:同直接法。
d.包被抗原:同直接法。
e.抗体:抗赭曲霉毒素 A 单克隆抗体。
f.酶标二抗:免抗鼠免疫球蛋白与辣根过氧化酶的结合物。
③测定方法
a.提取与净化 同直接法。
b.具体步骤 用包被抗原(10μg/mL)包被酶标板,每孔100μL,4℃过夜;酶标板用洗液洗3次,每次3min 后,加入不同浓度的赭曲霉毒素 A 标准溶液(制作标准曲线)或样品提取液(检测样品中的毒素含量)与抗体溶液(1:20000)的混合液(1:1,每孔10μL,该混合液应于使用的前一天配好,4℃过夜备用),置37℃,1h;酶标板洗3次,每次3min后,加入酶标二抗,每孔100μL,37℃,1.5h;同上述洗涤后,加入底物溶液,每孔100μL,37℃,30min;用终止液终止反应,每孔50μL,于波长450nm 处测定 OD 值。
c.结果判定 同直接法。
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