PCR扩增产物的分析方法
扩增产物的测定有各种方法,如电泳、限制性酶切、斑点印迹、探针杂交、测序、分光光度法定量等,但临床PCR检验项目基本上都使用探针杂交方法。
杂交结果不充分的原因可能是基因探针不合适、标记方法不对、对探针的标记不够、杂交或洗涤方法不合适等。
最常使用的基因探针有:DNA片段、合成的寡核苷酸和体外转录的反义RNA探针。探针的标记物常用的有生物素、地高辛、荧光素和同位素等。
在扩增后的杂交检测中, 应该严格遵守商品试剂盒确定的杂交程序和杂交条件。温度太低或离子强度太高都会降低杂交的严格性,还会给检测信号的特异性带来负面影响。相反,提高温度和/或降低离子强度会增加杂交的严格性。因此,严密控制温度和试剂的离子强度是避免假阳性和假阴性结果的先决条件。要注意的是,温度和离子强度不能同时改变。
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