PCR基因扩增及扩增产物的回收实验原理及过程
实验目的
为了获得大量的AKP基因，我们需要将目的基因通过PCR扩增基因剂量，方便下一步实验作基因重组。
我们需要注意PCR产物的准确性和产率。特别注意引物、复性温度、TaqE对准确性的影响和延伸时间（1000bp/min）、Mg2+浓度、循环数（小于等于30）对产率的影响。
同时，我们要掌握PCR基因扩增及扩增产物的回收的基本原理和实验技术方法。
实验原理及过程
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实验步骤 |
实验原理 |
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1 PCR体系的准备和PCR扩增的开始 |
2.5mmol/L dNTP Mixture 4.0uL
10xbuffer Mg2+ Ex－TaqE ddH2O 40uL primer 4uL 模板DNA 2uL 940C,2’ 940C 1’ 420C 1’ 720C 2’ 720C 10’ I-------30cycles----I |
聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，即PCR技术。 在合适条件下，这种循环不断重复，前一个循环的产物可作为后一循环的模板参与DNA的合成，最终使产物DNA的量按2n方式扩增。 理论上讲经过30次的循环反应，DNA扩增倍数为106-109。
PCR引物的设计至关重要，3’端要严格配对，5’可以引入酶切位点，也可以由此控制Tm值和CG的比值。 TaqE有最适温度和反应的活性，要注意它有加尾活性。 循环数超过30个以后，因为产物数量增加和反应物数量的减少，反应速度降低，这时对反映的产率已经没有贡献，反而副产物增多,影响效果。所以，循环数不应超过30。 |
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2 PCR产物电泳 |
0.8 %Agarose（1×TAE） 80伏恒压电泳 全部PCR产物上样电泳： 6uL 10xloading 6uL SYBR marker部分： 10uL marker（含loading buffer） 1uL SYBR |
因为PCR产物会有一些副产物，所以要用电泳的方法分离各种PCR产物。这样也能分离TaqE 等杂质。 为了分辨PCR产物和PCR副产品，需要跑一个分子量marker，我们的产物是1.6kp。 用TAE的原因是高严可以降低Agarose熔点，促进之后的DNA 吸附。 |
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3 PCR产物的回收（玻璃奶吸附法） |
1) | 紫外灯下切胶，称胶重 |
SYBR会使DNA部分显出绿色荧光，在紫外灯下辨认绿色荧光，可将胶切下。 |
| 2) | 每100mg胶加入300 uL溶胶液，50 oC溶胶 | 让DNA充分释放到液体中。 | |
| 3) | 将在-20 oC冻存的玻璃奶解冻，振匀！！ | 玻璃奶为细微的玻璃小颗粒，因酷似奶状而得名。它为悬浊液，而可以起吸附作用的小颗粒会沉降下来，所以，只有摇匀，我们才能渠道足量的玻璃小颗粒，完成分离的过程。 | |
| 4) | 在溶解后的胶液中加入10 uL玻璃奶，吹打均匀，冰浴沉淀10min， 10,000rpm离心1min，去上清。 |
这是一个类似于吸附层析的过程。DNA会特异的吸附于玻璃奶的小颗粒上，而胶不会吸附于其上，故可以起到分离的效果。 高盐能促进吸附。 |
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| 5) | 在离心所得沉淀中加入200 uL稀释浓缩洗胶液（3体积浓缩洗胶液加入7体积无水乙醇即得稀释液），吹打均匀，10,000rpm离心1min，去上清，如此洗两次。 | 这是一个洗涤的过程。 | |
| 6) | 50 0C干燥。 | ||
| 7) | 加入20 uL TE，吹打均匀，60 oC 5-10min 溶解DNA，12,000rpm 2min，收集上清为回收的PCR产物，-20oC保存。 |
此步骤是解析。 让DNA释放到溶液中，李新的方法可以将DNA纯化。 低盐有利于解吸附。 |
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检测是否含有DNA 取2uLDNA混合0.5uLSYBR，直接到紫外灯下观察，若有绿色荧光，则证明有DNA存在。 |
实验结果及分析
本次试验中，在最后一步检测中看到了荧光，说明了DNA的存在，证明回收到了PCR的产物
