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超氧化物歧化酶的测定方法

2022.9.16

超氧化物歧化酶活性的主要测定方法有直接法、邻苯三酚自氧化法、细胞色素C还原法、化学发光法及荧光动力学法等。近年来又建立了多种新方法,如免疫学方法、简易凝胶过滤扩散法、极谱氧电极法、微量测活方法等 。

1.直接法 原理是根据O2.- 或产生O2.- 的物质本身的性质测定O2.-的歧化量,从而确定SOD的活性。经典的直接法包括:脉冲辐射分解法、电子顺磁共振波法(EPR)、核磁共振法。由于所需的仪器设备价格昂贵,一般较少应用。

2.邻苯三酚自氧化法:原理是基于经典的分光光度法,在碱性条件下,邻苯三酚自氧化成红桔酚,用紫外-可见光谱跟踪波长为325nm、420nm或650nm(经典为420nm),同时产生O2.-,SOD催化O2.- 发生歧化反应从而抑制邻苯三酚的自氧化,样品对邻苯三酚自氧化速率的抑制率,可反映样品中的SOD含量。本法具有特异性强,所需样本量少(仅50μl),操作快速简单,重复性好,灵敏度高,试剂简单等优点。

3.细胞色素C还原法:原理是黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶体系中产生的O2.-使一定量的氧化型细胞色素C还原为还原型细胞色素C,后者在550nm有最大光吸收。在SOD存在时,由于一部分O2.-被SOD催化而歧化,O2.-还原细胞色素C的反应速度则相应减少,即其反应受到抑制。将抑制反应的百分数与SOD浓度作图可得到抑制曲线,由此计算样品中SOD活性。本法是间接法中的经典方法,但本法灵敏度较低。

4.化学发光法:原理是黄嘌呤氧化酶在有氧条件下,催化底物黄嘌呤或次黄嘌呤发生氧化反应生成尿酸,同时产生O2.-。后者可与化学发光剂鲁米诺反应,使其产生激发。SOD能清除O2.-从而抑制鲁米诺的化学发光。本法可应用于SOD的微量测定,不仅灵敏度高,简便易行,而且特异性与准确性至少与细胞色素C还原法类似。

5.免疫学方法:其测定的是SOD活性,免疫学方法则可测定样品中SOD的质量,因此特异性较好,是较理想的测定SOD方法,免疫法有放射免疫法、化学发光免疫分析法、ELISA法等。但其缺陷是只能测定抗体相应的抗原,对于检测不同种类的SOD,则须制备相应的特异性抗体,手续繁琐。


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