三箱社交实验及自发活动实验（二）
三箱社交实验及自发活动实验-雷帕霉素对自闭症大鼠病症行为的改善作用
2结果
2. 1雷帕霉素处理显著改善自闭症大鼠的社会交往能力
社会交往实验分析发现，与对照组相比，VPA处理组幼鼠社会交往能力显著下降(P <0.05)，体现为自我梳理时间增加，不愿意与陌生幼鼠交往，不愿接触新事物，符合自闭症儿童的行为特点。雷帕霉素单独处理组幼鼠与对照组相比社会交往能力无显著差异;而雷帕霉素联合处理则可以改善VPA处理导致的社会交往能力下降(P <0.05，图1) 。
2. 2雷帕霉素处理明显改善自闭症大鼠的神经病征行为
2. 2. 1雷帕霉素处理减少自闭症幼鼠在中央区活动时间如图2所示，对照组正常幼鼠在中央区活动时间较短，而VPA处理组幼鼠在中央区活动时间明显增加，与对照组存在明显差异(P <0.05)，符合自闭症的行为特点。雷帕霉素单独处理组幼鼠与对照组相比活动方式无显著差异;而雷帕霉素联合处理则可以减少自闭症幼鼠在中央区活动时间(P <0.05)，明显改善自闭症幼鼠的活动方式。
2. 2. 2雷帕霉素处理增加自闭症大鼠站立次数
如图3所示，正常对照组幼鼠的站立次数显著高于VPA处理组的自闭症模型鼠(P <0.05)，而雷帕霉素联合处理则可以明显增加自闭症幼鼠的站立次数(P<0. 05 )。
2. 3雷帕霉素处理增强自闭症大鼠前额叶皮层、海马和小脑组织的自噬水平
分别分离各组幼鼠的前额叶皮层、海马和小脑组织进行Western blot分析。如图4所示，与正常对照组相比，VPA处理组自闭症幼鼠的前额叶皮层、海马和小脑组织中的mTOR蛋白磷酸化明显增强，而雷帕霉素可以特异性抑制mTOR蛋白磷酸化。对自噬标志性蛋白LC3-II的水平进行分析发现，VPA处理组LC3-II水平明显降低(P<0.05)，表明在自闭症幼鼠的脑组织中自噬被抑制。使用雷帕霉素处理后，可以明显增加自闭症幼鼠前额叶皮层、海马和小脑组织中LC3-II的水平(P < 0. OS )，促进自噬发生。对LC3-II的水平进行定量分析也进一步支持了这一结果。
为进一步证实自噬在雷帕霉素改善自闭症幼鼠病症行为中的作用，对幼鼠前额叶组织中的自噬小体进行电镜观察，结果见图5。从图5可看出，正常幼鼠前额叶组织中存在少量自噬小体(箭头所示),VPA处理组则观察不到自噬小体的存在，而雷帕霉素处理组及VPA联合雷帕霉素处理均存在大量自噬小体。这一结果说明雷帕霉素处理确实可以增加自闭症幼鼠脑组织中的自噬水平。
3讨论
在针对自闭症的研究过程中，学者们建立了多种自闭症动物模型，如Tscl基因敲除鼠模型、病毒感染模型、VPA药物处理模型等。在这些模型中，VPA一次性注射药物模型是目前公认的一种较理想的自闭症动物模型。该模型可以在行为上模拟自闭症的刻板、重复等行为特征，且脑组织中的神经形态变化也与自闭症尸检报告也相似。社会交往实验是测验模型动
物社会交往能力的经典实验，实验中的陌生鼠与空笼子分别代表了新伙伴与新事物，通过分析规定时间内被检测鼠自我梳理、与陌生鼠及空笼子的接触时间，从而判断其社会交往能力。在本研究中，经VPA处理的模型鼠社会交往能力明显减弱，与自闭症症状相符。
神经行为学检测实验中，在中央区所呆时间长短反映了被测动物的空间认知能力，正常鼠对明亮、开放的新环境具有先天的躲避倾向，喜欢避开中央区、在四周角落中探寻，而对新环境认知能力差的自闭症鼠则停留在中央区的时间就会延长;站立次数反映了被测鼠在新环境中的探索能力，正常鼠站立次数多、探索能力强，而自闭症鼠则站立次数减少、探索能力减弱。本研究中VPA处理的自闭症模型鼠也具有相似的行为特征。VPA诱导大鼠发生自闭症的药理机制目前尚不明确。本实验结果表明，VPA可以增强大鼠前额叶、海马与小脑组织中的mTOR磷酸化，从而增强mTOR活性，并抑制自噬的标志性蛋白LC3-II的生成以及自噬小体的形成，这与TSC基因敲除自闭症模型鼠中mTOR的活性增强具有相似性，表明这可能是VPA诱导自闭症发生的重要机制。
雷帕霉素是一种新型大环内酷类免疫抑制剂。研究表明，在帕金森、亨廷顿病等神经退行性疾病动物模型中，雷帕霉素对神经元细胞均具有保护作用。在外伤性脑组织损伤动物模型中雷帕霉素处理也可以减少神经细胞的损害。但目前尚未见雷帕霉素处理改善自闭症症状的相关报道。雷帕霉素在细胞内的特异性分子靶点是mTOR，雷帕霉素可以特异性抑制mTOR的磷酸化并抑制其活性。本实验结果也表明，雷帕霉素处理后大鼠前额叶皮质、海马及小脑组织中mTOR磷酸化水平明显降低，mTOR活性明显下降。由于mTOR是调节细胞内代谢的关键分子，尤其与细胞自噬的发生密切相关，因此，雷帕霉素处理后神经组织中自噬水平的增加可能是其改善自闭症症状的重要机理。
自噬是细胞中降解长寿命蛋白与细胞器并回收利用相关降解产物的重要分解代谢机制，在细胞的生长、发育与疾病的发生中发挥重要作用。自噬水平的降低是多种神经退行性疾病如帕金森病、阿尔茨海默病、亨廷顿病等发病的重要原因。尽管自噬与自闭症的发病关系目前尚少见报道，但在多种自闭症模型动物中均发现了与自噬发生相关的信号通路的改变。如自闭症模型动物脑组织中Wnt信号通路的增强,TSC基因敲除自闭症模型鼠脑组织中mTOR信号通路的激活等，均可降低细胞中的自噬水平。由于mTOR通路是自噬发生的关键性上游通路，抑制该通路后可显著增强细胞内的自噬水平，因此本实验选用mTOR的特异性抑制剂雷帕霉素来抑制该通路并进而增强神经细胞中的自噬水平。实验结果也证实这一策略具有可行性，从而为自闭症的治疗提供了一定的理论与实验依据。
