三箱社交实验及自发活动实验（一）
三箱社交实验及自发活动实验-雷帕霉素对自闭症大鼠病症行为的改善作用
摘要：
目的探讨雷帕霉素(rapamycin)对自闭症大鼠病症行为的改善作用及相关机制。
方法采用丙戊酸钠( sodium valproate VPA)一次性腹腔注射孕12.5 d大鼠制备自闭症幼大鼠模型，雷帕霉素处理组于VPA注射后每天给大鼠口服4 mg/kg雷帕霉素直至断奶。将出生幼鼠分为4组:对照组，VPA处理组，雷帕霉素处理组与VPA联合雷帕霉素处理组。在幼鼠出生后35 d进行社会交往行为检测、神经行为学检测，并分离提取脑组织蛋白通过Western blot分析mTOR磷酸化水平及自噬标志蛋白LC3表达情况;电镜分析前额叶组织中自噬小体形成情况。结果成功制备自闭症大鼠模型。与对照相比，VPA处理组社会交往能力下降、在中央区活动时间增加、站立次数减少(P <0.05)，符合自闭症行为特征;雷帕霉素单独处理组无明显行为学变化;但雷帕霉素联合处理能明显改善VPA处理导致的自闭症行为症状(P <0.05) o Western blot结果显示，与对照组相比，VPA处理可增强大鼠前额叶、海马及小脑组织中mTOR磷酸化水平，并降低LC3-II表达水平;而雷帕霉素联合处理则能抑制上述脑组织中mTOR的磷酸化并增强LC3-II表达水平。电镜分析结果表明，VPA处理可减少幼鼠前额叶组织中的自噬小体，而雷帕霉素联合处理则能明显增加自噬小体的形成。
结论雷帕霉素可改善自闭症模型大鼠的病症行为，机制可能与抑制mTOR活性并增强细胞自噬相关。
关键词：雷帕霉素;自闭症;自噬
自闭症(autism)又称儿童孤独症，是以婴幼儿期就表现出交往障碍、语言障碍和(或)重复刻板行为为主要临床特征的一种脑发育障碍综合征，其发病率为2 / 1 000 } 6 / 1 000 }'}。目前我国约有60多万自闭症儿童，男孩多于女孩，并且发病率还呈上升趋势[}z}。自闭症的发病原因复杂，涉及遗传、免疫、环境、饮食、教育等多个方面，至今尚未完全阐明[3]。
研究表明，Tscl基因敲除小鼠具有自闭症类似症状，但详细的分子机制尚不明确[#]。由于Tscl基因是Akt-mammalian target of rapamycin ( mTOR)信号通路的重要中间分子[[5]，该基因缺失后会导致mTOR活性升高，进而引起细胞内多种代谢途径的改变，尤其是细胞自噬被抑制。因此本课题组设想mTOR活性升高导致的细胞自噬水平下降可能是引起自闭症发病的重要原因。为证明这一假说，本研究以自闭症大鼠为模型，观察脑组织中细胞自噬水平变化情况，并探讨mTOR抑制剂雷帕霉素(rapamycin)对自闭症大鼠病症行为的改善作用。
材料与方法
1.1实验动物
本实验所用Wistar大鼠由第三军医大学实验动物中心提供。成年清洁级Wistar雄性大鼠(体质量300-350 g) 12只，雌性大鼠(体质量200一250 g) 12只，饲养于第三军医大学实验动物中心。
1.2药品及试剂
丙戊酸钠( sodium valproate，VPA) , LC3抗体购自Sigma公司，磷酸化mTOR抗体、GAPDH抗体购自CellSignaling公司，BCA蛋白浓度测定试剂盒和细胞裂解液购自江苏碧云天生物技术公司，PVDF膜购自美国Bio}ad公司，蛋白Marke:购自北京中衫公司。
1.3动物模型制备与分组
参照Sehneider等的方法，将雌、雄大鼠合笼过夜，次日早晨对雌鼠进行阴道涂片检查，发现阴栓者记为妊娠第1天(E1)，并将孕母鼠单独饲养。将孕鼠分为4组，分别为对照组、VPA处理组(即模型组)、雷帕霉素处理组及VPA联合雷帕霉素处理组，每组3只。
VPA处理组与VPA联合雷帕霉素处理组在E12. 5 d时给孕鼠腹腔注射VPA，剂量为600 mg/kg;同时给对照组与雷帕霉素处理组孕鼠腹腔注射等量的生理盐水;雷帕霉素处理组及VPA联合雷帕霉素处理组在E12. 5 d后每天给孕鼠口服雷帕霉素(4 mg/kg)直至仔鼠断奶，其他小组口服等剂量溶剂(麻油)。VPA处理组孕鼠产下的仔鼠即为孤独症模型组，而对照组孕
鼠产下的仔鼠为正常对照组。幼鼠出生后第1天记为P1。各组幼鼠统一于出生后23 d (P23 )断奶。
1.4社会交往行为检测
在幼鼠出生后35 d，分别从每组各选择6只进行检测。检测鼠均为雄性，出生时间相差不超过1d，体质量差别小于15 g，分笼饲养。检测在大小为60 cm x60 cm x 60 cm的透明三室箱内进行。实验前1d，所有被检测鼠放入检测室适应环境。实验时将1只被测鼠放入中间小室先适应10 min。然后在左侧小室放置空铁丝笼子，右侧小室放入陌生幼鼠并用同样的铁丝笼子罩住。打开中间小室进入左、右小室的通道，摄像记录10 min内被检测鼠的行为，通过Supermaze软件系统分别统计被检测鼠自梳理(非社交行为)、嗅铁丝笼子和陌生鼠(社交行为)时间。
1.5神经行为学检测
同样在幼鼠出生后35 d检测，分别从模型组与对照组各选择5只进行检测，被检测大鼠的选择标准同1.4。检测在大小为25 cm x 25 cm x 38 cm的封闭箱内进行，箱子中央12 cm x 12 cm区域为中央区。实验前1d，所有被检测鼠放入检测室适应环境。检测时将被检测鼠放入检测箱中央，摄像记录5 min内被检测鼠的行为，通过Supermaze软件系统分别统计被检测鼠在中央区活动时间及直立次数。
1.6Western blot检测
将出生后35 d的幼鼠断颈处死，立即分离前额叶皮层、海马和小脑组织。将各组织分别按100 mg/mL比例加入组织裂解液进行匀浆。冰上静置30 min后于4 0C 12 000 r/min离心30 min。取上清，测定蛋白浓度后置一80℃冰箱备用。将含50 ug总蛋白的组织样品经SDS聚丙烯酞胺凝胶电泳分离后转移到PVDF膜上。经5%脱脂奶粉封闭后加入一抗4℃孵育过夜，PEST洗涤后再加入二抗，室温孵育1h。再经PEST漂洗后加入化学发光液进行曝光显影。
1.7电镜分析
将出生后35 d的幼鼠断颈处死，立即分离前额叶皮层、海马和小脑组织。将各组织分别进行固定、块染、脱水、浸透、包埋后切片，置于铜网上进行透射电镜观察。全部样品处理过程及观察、拍照均在第三军医大学中心实验室完成。
1.8统计学分析
采用SPSS 19. 0统计软件进行数据分析，所有数据均用x士s表示，均数比较采用单因素方差分析。
