抗体的概念动物产生抗体的机理及单克隆抗体的制备方法
抗体的概念
动物机体受到抗原物质的刺激后, 由B淋巴细胞转化为浆细胞产生的, 能与相应抗原发生特异性结合反应的免疫球蛋白, 这类免疫球蛋白称为抗体(Antibody,简称 Ab)。
免疫球蛋白
免疫球蛋白(Immunogolobulin, 简称Ig) 是指存在于人和动物血液(血清)、组织液及其它外分泌液中的一类具有相似结构的球蛋白。
Ig根据单体数目、分子量、含糖量、电泳移动率等特点分为6类，主要是IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。与免疫测定有关的Ig主要为IgG和IgM。
Ig由两个轻链（L）和两个重链（H）的单体组成，经二硫键连接呈Y型。Ig的轻链是相同的，有κ（kappa）和λ（Lambda）两种型别。
五类Ig的重链结构不同，这决定了它们的抗原性也不同。IgG和IgM的重链分别称为γ
（gamma）链和μ（mu）链。
IgG的结构见图。
IgG可被木瓜蛋白酶分解为三个区段，其中两个相同的区段称抗原结合片段（Fab）。每个Fab都保存结合抗原的能力，但只有一个抗原结合位点，是单价的，与抗原结合后不出现凝集或沉淀。另一区段称Fc段，无抗体活性，但具有IgG特有的抗原性。
IgG可被胃蛋白酶分解为两个片段，一个Fab双体，称F（ab'）2，能和两个相同的抗原结合；另一片段类似Fc，随后被分解成小分子多肽，无生物活性。
IgM是由五个单体组成的五聚体，含10个重链和10个轻链，具有10个抗原结合价，由于空间位置的影响，只表现为五个抗原结合价。IgM分子量约为900000，IgG分子量约为150000。
多克隆抗体(Polyclonal antibody，PAb):
抗原免疫动物所获得的免疫血清或抗血清是多种抗体的混合物, 它是由抗原中多种抗原决定簇（即抗原表位）刺激多株B细胞增殖分化所产生的, 称为多克隆抗体，也称抗血清。
单克隆抗体(Monoclonal antibody, MAb) :
用杂交瘤技术获得能分泌针对某一种抗原决定簇的特异性抗体的杂交瘤细胞系即单克隆抗体细胞系，由此单克隆细胞系产生的大量单一、同质的、高纯度的针对单一抗原决定簇的特异性抗体，叫单克隆抗体。（由于每一个免疫淋巴细胞只能分泌针对单一抗原决定簇的特异性抗体）。
动物产生抗体的机理
抗原（非自己的物质）免疫动物
→ 激活免疫B细胞
→ 转化成浆细胞
→分泌针对免疫抗原的特异性的抗体
(一)抗原（Antigen, Ag）是指那些能诱导动物免疫系统发生免疫应答、产生抗体同时又能与免疫应答产物在体内外特异性结合、发生免疫反应的物质。
抗原的反应性取决于抗原决定簇（antigenic determinant），或称为表位（epitope）。一个抗原分子可带有不同的决定簇，在免疫测定中，抗原是指能与抗体结合的物质。能在机体中引起抗体产生的抗原多为分子量大于5000的蛋白质，例如乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）、甲胎蛋白（AFP）等。
(二） 抗原的基本特性
抗原具有抗原性(antigenicity), 其包括免疫原性与反应原性两方面的含义。
1、免疫原性(immunogenicity)
是指抗原能刺激机体的免疫系统，使之产生抗体的特性。
2.反应原性(reactinogenicity)
是指抗原与相应的抗体发生反应的特性, 此特性又称为免疫反应性(immunoreactivity)。
抗原分为完全抗原及不完全抗原：
① 完全抗原 既具有免疫原性又有反应原性的物质称为完全抗原(complete antigen)。如病毒、细菌、真菌等微生物和蛋白质等分子量大于5000Da生物物质；
② 不完全抗原 只具有反应原性而缺乏免疫原性的物质称为不完全抗原(incomplete antigen), 亦称为半抗原(hapten)。多糖、药物、激素、肽类、抗生素、农药等分子量小于5000 Da 物质半抗原需与BSA、OVA等载体蛋白交联后成会完全抗原才能刺激动物产生相应的抗体；
半抗原-载体蛋白：
半抗原单独作用机体的免疫系统时无免疫原性，当与蛋白 载体（carrier)结合形成半抗原-载体复合物时，即可获得免疫原性，这种复合物不但可刺激机体的免疫系统产生针对半抗原的抗体，也可以刺激机体产生针对蛋白质载体的抗体
构成抗原的条件：
一、异物性，又称为异质性或异源性
正常情况下，自身组织或细胞对机体本身无免疫原性。而异种或异体物质，以及化学组成或结构发生改变的和由于某种因素而暴露的在胚胎期与免疫系统隔绝的自身物质则为良好的抗原。
二、理化性状
大分子物质
抗原的免疫原性与其分子大小有直接关系：
1、免疫原性良好的物质分子量一般都在10000以上, 在一定条件下, 分子量越大, 免疫原性越强；
2、分子量小于5000的物质免疫原性较弱；
3、分子量小于1000的物质为半抗原, 没有免疫原性。但与蛋白质载体结合后可获得免疫原性；
抗原须为大分子物质的原因可能是：
1、抗原分子质量越大，表面特殊化学基团（抗原决定簇）就越多，因而就越能有效地刺激免疫细胞，产生免疫应答。
2、大分子抗原物质化学组成复杂、结构稳定，不易被破坏和清除，在体内停留时间较长，故可持续刺激免疫系统发生免疫应答。
一般来讲, 分子量越小, 免疫原性越弱, 甚至失去免疫原性。因分子量越小的物质越倾向于诱导细胞免疫而缺乏诱导抗体形成的体液免疫的能力。
人工合成短肽链需与大分子载体连接才能激发机体的体液免疫和细胞免疫应答。
三、化学组成、分子结构
大分子物质有时也并非一定是良好的免疫原，如分子量 99787的明胶，但因其分子结构和空间构象简单，为直链氨基酸、易降解而使其免疫原性很弱。
一般来说,分子结构和空间构象愈复杂的物质免疫原性愈强。如含芳香族氨基酸的蛋白质比含非芳香族氨基酸的蛋白质免疫原性强。
多糖分子的免疫原性则主要取决于单糖的数目和类型，并且结构复杂者免疫原性强。
如果用理化方法改变抗原的空间构象, 其原有的免疫原性也随之消失。同一分子不同的光学异构体之间也有免疫原性的差异。
抗原分子并非所有的基团都作用一致, 决定其免疫活性的只是其中的一小部分抗原区域。
抗原决定簇(antigenic determinant)是指存在于抗原分子表面的能够决定抗原特异性的特殊化学基团，是与抗体结合的位点。由于抗原决定簇通常位于抗原分子表面, 因而又称为表位(epitope)
抗原决定簇是具有特殊立体构型和免疫活性的化学基团。
抗原决定簇决定着抗原的特异性, 即决定着抗原与抗体发生特异结合的能力。
抗原分子母体表面有不同的抗原决定簇，即具有不同的特异性, 而同一化学基团的不同异构体均可影响抗原的特异性。
功能性抗原决定簇和隐蔽的抗原决定簇
1、功能性抗原决定簇：
存在抗原分子表面，能被淋巴细胞识别，同时能与抗体特异性结合而发生免疫反应的抗原决定簇，称为功能性决定簇。
2、隐蔽的抗原决定簇：隐藏在抗原分子内部的抗原决定簇
佐剂(Adjuvan)： 先于抗原或与抗原混合后同时注入动物体内，能非特异性地改变或增强机体对该抗原的特异性免疫应答，发挥辅助作用的一类物质。
佐剂作用：
保护抗原，延长其在体内的滞留时间，使抗原缓慢释放；增强机体对该抗原的特异性免疫应答；增强免疫原性。
最常用的佐剂：
弗氏佐剂（Freund’s adjuvant）是用矿物油（石腊油）、乳化剂（羊毛脂）和杀死的结核分枝杆菌(卡介苗)组成的油包水乳化佐剂，这三种成分俱全的佐剂称为弗氏完全佐剂，不含结核分枝杆菌的佐剂为弗氏不完全佐剂。
的1、一只兔子每次的免疫剂量：
细胞抗原不低于1x107 ；
可溶性抗原100ug-1mg(300-800ug)；
合成抗原为2mg（半抗原约为20-200ug）
2、免疫途径、免疫次数和间隔时间：
选用皮内、皮下、肌肉、静脉、腹腔或淋巴结内途径进行免疫，一般完全抗原免疫3-4次，合成半抗原免疫6次以上，两次免疫间隔时间一般为3周。
【一免】：抗原 300-500ul抗原（浓度为1ug/ul）+300-500ul福氏完全佐剂+适量青霉素和链霉素混合，充分乳化，兔子背腹部剪毛后皮下多点注射免疫；（免疫两只兔子）
注：抗原完全溶解后摇匀再取样；福氏完全佐剂需摇匀后吸取免疫前取少量血清，作阴性对照
【二免】：间隔3周，300ul-500ul抗原+300ul-500ul福氏不完全佐剂+适量青霉素和链霉素混合，充分乳化，兔子背腹部剪毛后皮下多点注射免疫；
【三免】：间隔3周，300ul抗原+300ul生理盐水+适量青霉素和链霉素混合，二侧腿部肌注免疫；
【四免】：间隔14天，300ul抗原+300ul生理盐水+适量青霉素和链霉素混合，二侧腿部肌注免疫；
【五免】：间隔14天，300ul抗原+300ul生理盐水+适量青霉素和链霉素混合，二侧腿部肌注免疫；
注：
① 每次免疫后取少量血清，用琼脂扩散试验或间接ELISA测定效价，一般琼脂扩散效价达1：32或间接ELISA测定效价达1：500000时可杀兔取血；
② 末免后7-10天取血放与平皿中，置37℃放30分钟，4 ℃ 放置3-4小时，待血块收缩后，吸血清到离心管，5000rpm离心5分钟，上清即为血清，1.5毫升的离心管分装-20 ℃ 保存。
淋巴细胞杂交瘤技术与单克隆抗体
Köhler和Milstein在1975年建立了体外淋巴细胞杂交瘤技术，用人工的方法将产生特异性抗体的B细胞与骨髓瘤细胞融合，形成B细胞杂交瘤，这种杂交瘤细胞既具有骨髓瘤细胞无限繁殖的特性, 又具有B细胞分泌特异性抗体的能力, 由克隆化的B细胞杂交瘤所产生的抗体即为单克隆抗体
单克隆抗体制备原理
单克隆抗体杂交瘤技术基本流程
单克隆抗体的制备步骤
1、免疫原的制备；
2、免疫动物 ；选择体重18-20g BALB/C 雌性小鼠用于免疫。50-100ug抗原/只与等体积福氏完全佐剂混合，充分乳化后，经背腹部皮下多点注射及腹腔注射相结合的方式免疫，总的免疫体积0.2-0.3ml每只；间隔3周，取与一免减半量抗原和等体积的福氏不完全佐剂充分乳化后，第二次腹腔注射0.2-0.3ml每只；过2-3周后用加倍剂量的抗原进行腹腔注射，3天后取脾细胞进行融合；
3、细胞融合 ；取上述免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0）按5-10：1的比例，在无血清的RPMI-1640培养基中混匀，1500rpm离心5min，去除培养基；用50% PEG（Sigma,分子量1500－4000）作为融合剂，在37℃下水浴下加入0.5-0.7ml，使其融合2min；用无血清的RPMI-1640培养基终止融合后1500rpm离心5min，沉淀用HAT培养基悬浮，分装到96孔含有饲养细胞的细胞板中，37℃，5% CO2的细胞培养箱中培养。杂交瘤细胞的制备过程
4、杂交瘤细胞及阳性孔的筛选；细胞培养器皿中培养5天后，用HAT培养基换液一次，第10天用HT培养基换液，等到融合细胞覆盖孔底10%-50%时，用常规间接ELISA方法筛选阳性孔，获得对上述抗原有反应的阳性孔；
5、阳性孔的特异性检测及特异性阳性孔的克隆；阳性孔的特异性鉴定采用间接ELISA方法：用包被液稀释成1-10ug/mL的抗原100ul/孔包被ELISA板，4℃过夜，使其吸附于聚苯乙烯板孔；PBST洗涤三次后用1-10％的脱脂奶粉封闭30-60min；加入阳性孔培养上清100ul/孔，37℃ 1-2 小时；PBST洗涤三次后加入按说明书稀释10000倍的辣根过氧化物酶标记兔抗鼠IgG二抗（Sigma公司）100ul/孔，37℃ 1-2小时，PBST洗涤四次后，用OPD-H2O2底物显色，2mol/L H2SO4终止反应后，用酶标仪读取OD492的值，以与阴性OD值比值大于2.1为阳性。获对抗原有特异性反应的阳性孔。筛选出的特异性阳性孔用常规的有限稀释法克隆，获能分泌抗原特异性抗体的杂交瘤细胞株。细胞株进一步扩大培养，用于制备单抗腹水和液氮冻存；
6、杂交瘤细胞和一般细胞的冻存及复苏方法；杂交瘤细胞通常用含有8％-10%的二甲亚砜和30％小牛血清的培养基冻存于液氮中，在液氮中细胞可以保存多年，在-80℃中可以作3-6个月短期保存。冻存细胞需要缓慢降温（4℃冰箱放置15-30分钟，-20℃冰箱放置30－60分钟，-80℃超低温冰箱中放置24小时），然后放置液氮中长期保存；也可用细胞程序冻存盒直接放置-80℃超低温冰箱。复苏细胞时需快速升温，这样可以确保细胞有较高的存活率。冻存细胞管直接放入37℃水中快速升温复苏，离心后去冻存液，沉淀的细胞用培养基悬浮后细胞培养箱培养；
7、单克隆抗体腹水制备及纯化；取8周龄左右BALB/C小鼠，腹腔注射0.3-0.5ml降植烷，7-10天后腹腔注入5-10×105个杂交瘤细胞，7-10天后可见小鼠腹部明显膨大，取腹水，3000rpm离心3min，收集上清液，即为单克隆抗体腹水。纯化：取1倍体积腹水加2倍体积0.06M PH4.8醋酸缓冲液稀释，加辛酸（30ul/ml腹水），室温下边加边搅拌，4℃澄清1小时，12000rpm离心30min，收集上清，再用50%饱和硫酸铵沉淀免疫球蛋白，4℃放置2小时，5000rpm离心5min，沉淀用2倍体积的PBS溶液溶解，在4℃PBS流动透析24小时后即获纯化的抗体，-70℃保存；
8、单克隆抗体的亚类鉴定和腹水效价测定；将单抗腹水与Sigma公司的标准抗BALB/C 小鼠IgA、IgG1、IgG2a、 IgG2b、IgG3、IgM抗体，作双向琼脂扩散试验或双抗夹心ELISA方法鉴定。用常规间接ELISA方法检测单抗腹水效价，腹水效价在10-5-10-7之间的可用于实际应用；
酶联免疫吸附试验技术（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA）（定量、定性实验）
ELISA是在免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)的基础上发展起来的一种免疫测定技术，既可以定性也可以定量。主要过程包括将已知抗原(抗体)吸附在固相载体即聚苯乙烯微量滴定板上称为包被,然后用封闭液（5% BSA/PBS 溶液）将空余的位点占据，以避免后续抗体非特异性吸附。洗涤后加待测抗体(抗原), 再加相应酶标记抗体，形成已知抗原--待测抗体--酶标二抗的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算待测抗体(抗原)的量。
ELISA原理
（1） 抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面,可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附,并保持其免疫学活性；
（2） 抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物,而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；
（3） 酶结合物与相应抗原或抗体结合后,可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在,而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的,因此,可以按底物显色的程度显示试验结果；
常用ELISA方法
1、直接法：检测抗原
A:将待检测抗原吸附在固相载体表面；
B:加酶标抗体，形成抗原-抗体-酶复合物；
C:加底物。底物的降解量＝抗原量。
2、间接法 ：检测抗体（本次ELISA方法）
A: 将已知抗原吸附于固相载体表面；
B: 加待检测抗体，形成抗原抗体复合物；
C: 加酶标二抗；
D: 加底物。测定底物降解量=抗体量
3、双抗体夹心法：检测抗原
A:将抗原免疫第一种动物获得的抗体吸附于固相表面；
B:加待检抗原，形成抗原-抗体复合物；
C:加抗原免疫第二种动物获得的抗体，形成抗体抗原抗体复合物；
D:加酶标抗抗体(第二种动物抗体的抗体)；
E:加底物。底物的降解量＝抗原量。
4 竞争法：测定抗原
A:将抗体吸附在固相载体表面；
B:对照孔只加入酶标抗原；
C:样品孔加入酶标抗原和待测抗原，竞争结合抗体；
D:加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差＝未知抗原量。
