ngs检测是干什么
最近常有人问我怎样才能将NGS的遗传病检测开展起来。今天我就根据我们的粗浅经验写上几篇介绍一下心得。分别从前期准备、如何入门、逐步进阶、生信深化和自主创新几个步骤，分别介绍，主要给打算开展NGS检测服务的临床机构提供参考。才疏学浅，一家之言，如有不妥，还请海涵。
今天是第一篇，准备篇。
准备啥呢？一方面准备对照检测方案，先做起来，积累经验值，而且也能用来日后做验证，结果准不准总得有根绳子拽在自己手里才放心；另外，做家属验证的时候也需要有个针对性的便宜又准确的方法，总之是不会浪费的。另一方面，就是准备遗传学的基本知识，结果出来了才发现自己也说不清楚(这是正常的啦，罕见病几千种呢)，但不知道该怎么去查清楚，那就尴尬了。
先来看看NGS能做什么？
全基因测序（WGS）、全外显子测序（WES）在理论上可用于检测基因突变、拷贝数变异（CNV）、纯合状态（LOH）、单亲二体（UPD），延伸开来还可用于易位、倒位等染色体结构异常的判断。内容太多，就先挑几个最重要的来准备吧。
1、基因突变，NGS的最基本应用。
WES可能出错的地方：探针覆盖不全、测序深度不足、测序错误、重复序列、同源序列等。
基本的技术准备：Sanger测序。
虽然看起来NGS老牛x了，简直啥都能干。不过老话说得好，十八般武艺样样都通，难免样样稀松。WES一次能查出来几万个位点，总有一些不那么靠谱的，像测序深度太低或者测序的末端，还有第一外显子等探针比较少的地方，还有一些是内含子上较远的位置，在WES里面都是有可能出错的。所以，WES的结果依然需要Sanger测序来验证。而且，NGS也不是包打天下的，对于WES探针未覆盖到的区域，或者重复序列之类的结构特别之处，WES都会歇菜，还需要Sanger测序来补充。所以Sanger测序的作为技术储备是必不可少的。
除此以外，还有Sanger测序的升级版，比如需要Long Range PCR+Sanger测序，用于分析SMA、HLA等同源序列的区域；Sanger测序的精简版，毛细管电泳，用于亨廷顿、脆X等STR区域检测等。这些技术也得准备好，要知道患者可不会按着你的检测目录来生病，等病人都来了再手忙脚乱地到处找方案容易忙中出错。
必要的知识储备：遗传学知识和文献检索技能。
常见病大家都熟，便宜、快速又准确的检测方法也很多。所以能摊上NGS的，都是少见或者罕见的疾病。可是少见病和罕见病见得少啊，都不熟，这个时候，充分的知识储备、完善的文献检索技能、还有谨慎的态度，就很重要了。
拿地贫来举例吧，不是所有的a地贫突变、β地贫突变都是导致地贫的，a有缺失、有突变、有涉及单个基因、两个基因、β有β0还有β+，严重程度各不相同，并不是所有的突变都会致病、而且也不是所有的致病性的位点凑到一起都会导致重型地贫。即使数据库里面确认是致病性的，有些突变可能只是导致异常血红蛋白病、镰形细胞贫血等疾病。并不是所有hba、hbb的致病突变就一定是致“地中海贫血”这个病的。在实际工作中，搞不清楚地贫和hba、hbb突变的关系而闹笑话的情况也见得不少了，一不小心就会把不重要的血红蛋白病突变定义为地贫致病位点，把人吓个半死，一定要小心，多学习，多咨询，下结论一定要谨慎。（可以翻翻之前的文章，之前燕燕讲遗传中提到过相关案例）
地贫在华南地区比较常见，是个很好的学习模板。对于非华南地区的同行来说，以耳聋作为学习的模板也是非常合适的。
现在国内很多地区都开展了耳聋基因的突变筛查，9位点筛查的携带率一般在5%以上，发病率也不低，还是比较容易找到学习对象的。常用的GJB2、GJB3、PDS、mtDNA的常见突变组合包含了显性遗传、隐性遗传、线粒体遗传不同的模式，看上一圈各种不同遗传模式的特点就全有了。此外，GJB2某些位点还涉及皮肤病的基因多效性现象、或者涉及不完全外显的遗传模式、甚至还有与其他基因共同作用，体现双基因遗传的突变位点。GJB3、PDS的延迟显性，PDS的剧烈运动以后的诱发表现，PDS的P为主、D为主或者P+D都出现的临床表现模式都是临床遗传过程中常常出现，但传统教科书上较少强调的现象。把耳聋仔细整理上一轮，日后见到其他遗传病以及基因突变的时候，就能做到心中有大局观，不会随意给基因和突变下结论了。遗传机制丰富多样、医学科学还在不断完善，既往的结论不见得就是全面的结论，碰到一个新的疾病，一定要纵览OMIM、GeneReview、Clingen、Clinvar各种数据库、文献以后再酌情下结论才比较安心。
2、大片段拷贝数变异（CNV）及LOH、UPD，采用CNV-SEQ和WES-CNV分析，很火的概念，大有取代CMA之势。
染色体是按条来遗传的，父母染色体结构异常是很多胎儿染色体CNV异常的基础。换句话说，就算用NGS查到了CNV，也得能凭空反推可能的发生机制，下次的再发概率，后代的遗传风险概率等一系列病人最关心的问题才行。这个时候，临床医生非常需要细胞遗传学的知识储备。
即使现在被视为金标准的CMA技术，在开始的若干年内，也是需要采用FISH技术作为验证的。而且在临床上直到现在，依然有很多CNV需要去判断结构、来源、位置，也是需要FISH技术来确认。FISH与核型分析作为常规观察染色体结构的技术，必不可少。所以在开展NGS之前，临床实验室还得有细胞遗传学检测技术的储备。
搞清楚CNV的结构来源有多重要呢？光讲理论我头疼，搞些题目来大家一起头疼吧！
a、一个患儿发现染色体上一段大片段缺失、一段大片段重复，中间夹着一段正常，与缺失直接连着重复的患儿相比，其父母下胎生育染色体异常患儿的比例会有什么差别？
b、对于染色体一个中间大片段重复的患儿，与一个染色体末端大片段重复的患儿，发生机制上有什么不同，遗传检测上需要注意什么？
c、发生在染色体末端的LOH与发生在中间的LOH，后续的检查与预后判断上，有什么不同？
d、一个发生平衡易位的患者，其配子会有多少种核型？
以上问题主要是从染色体的结构与正常遗传规律和变异发生机制的角度来分析。对于从染色体核型分析做到FISH、再做到CMA的机构来说应该早就被蹂躏过千百次，见怪不怪，云淡风轻了。如果还没有被蹂躏过的，为了尽快接招，赶紧准备起来吧。
3、小片段CNV
片段越大NGS检测CNV的准确率越高，但是小片段依然可能就是致病原因，当z值较高（可能性较大）的时候，就需要去验证了。方法很多，用MLPA、QF PCR、Real time PCR等，选习惯的方法就行。
准备篇就讲到这里，做好了细胞遗传学和分子遗传学的技术准备，以及医学遗传学的知识储备之后，下次我们来讲讲怎么选平台、怎么选方案、怎么选检测目标、还有选什么样的大粗腿来合作的问题。
